新世代エキソサイトーシス光学プローブの開発

新一代胞吐光学探针的研制

基本信息

批准号：
19659051
负责人：
八尾寛
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

VAMP-pHluorin(シナプトフルオリン)は、pH感受性GFP改変タンパク質であるpHluorinを、シナプス小胞膜タンパク質であるVAMP-2(Synaptobrevin-2)のC末端側に融合させたものである。シナプス小胞内腔のpHは、エキソサイトーシス、エンドサイトーシスなどの過程で酸性(pH 5.6)→中性→酸性に変化する。VAMP-pHluorinの蛍光変化により、小胞ダイナミクスをリアルタイムに可視化するのが、シナプトフルオリン法である。従来の方法に比べ、シナプトフルオリン法によるエキソサイトーシス計測は高い感度を有しているといえる。しかし、(1)神経活動の際、内因性物質であるフラボンタンパク質(FAD)などに由来する自家蛍光がVAMP-pHluorinのS/Nを低下させる、(2)酸性環境におけるpHluorinの蛍光が微弱であり、VAMP-pHluorinを発現している終末を非活動時に形態的に同定するのが難しい、といった問題点が残されていた。造礁サンゴのDiscosoma種由来の蛍光タンパク質DsRedの改変体モノマーのひとつmOrangeは、pHluorinよりも長波長側に励起蛍光波長を持つ。本研究では、mOrangeのpH感受性を蛍光分光光度計で計測し、pKaを求めた。得られたpKaは7.1であり、mOrangeを用いることにより、S/Nが改良される可能性が示唆された。さらに、黄色蛍光タンパク質EYFPをドナー、mOrangeをアクセプターとするFRETによるレシオ型pHセンサーの作成を試みた。しかし、期待通りのFRETを得るには、リンカー部分の改善がさらに必要である。しかしVAMP-mOrange単独であっても、S/Nに改善が期待されるので、これを検証する目的で、VAMP-mOrangeをゲノムに導入したPC12細胞のin vivoの分泌システムを構築した。

VAMP-pHluorin（突触氟素）是将pH敏感的GFP修饰蛋白pHluorin与突触小泡膜蛋白VAMP-2（Synaptobrevin-2）的C末端融合而成的产品。在胞吐作用和内吞作用等过程中，突触小泡腔的 pH 值从酸性 (pH 5.6) 变为中性再变为酸性。 Synaptofluorin 方法通过改变 VAMP-pHluorin 的荧光来实时可视化囊泡动力学。可以说，使用突触氟素法的胞吐作用测量比传统方法具有更高的灵敏度。然而，存在以下问题：（1）在神经活动过程中，源自黄酮蛋白（FAD）等内源性物质的自发荧光降低了VAMP-pHluorin的S/N，以及（2）pHluorin的荧光在酸性环境中较弱。然而，当 VAMP-pHluorin 表达处于非活性状态时，很难从形态学上识别它们。 mOrange 是源自造礁珊瑚 Discosoma 物种的荧光蛋白 DsRed 的修饰单体，其激发荧光波长比 pHluorin 更长。在这项研究中，使用荧光分光光度计测量了 mOrange 的 pH 敏感性并测定了 pKa。获得的 pKa 为 7.1，表明使用 mOrange 可以提高 S/N。此外，我们尝试使用黄色荧光蛋白 EYFP 作为供体、mOrange 作为受体，利用 FRET 创建比率型 pH 传感器。然而，需要对连接器部分进行进一步改进才能获得预期的 FRET。然而，单独使用VAMP-mOrange有望提高S/N，因此为了验证这一点，我们构建了PC12细胞的体内分泌系统，其中VAMP-mOrange被引入到基因组中。