新世代エキソサイトーシス光学プローブの開発

新一代胞吐光学探针的研制

基本信息

批准号：
19659051
负责人：
八尾寛
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

VAMP-pHluorin(シナプトフルオリン)は、pH感受性GFP改変タンパク質であるpHluorinを、シナプス小胞膜タンパク質であるVAMP-2(Synaptobrevin-2)のC末端側に融合させたものである。シナプス小胞内腔のpHは、エキソサイトーシス、エンドサイトーシスなどの過程で酸性(pH 5.6)→中性→酸性に変化する。VAMP-pHluorinの蛍光変化により、小胞ダイナミクスをリアルタイムに可視化するのが、シナプトフルオリン法である。従来の方法に比べ、シナプトフルオリン法によるエキソサイトーシス計測は高い感度を有しているといえる。しかし、(1)神経活動の際、内因性物質であるフラボンタンパク質(FAD)などに由来する自家蛍光がVAMP-pHluorinのS/Nを低下させる、(2)酸性環境におけるpHluorinの蛍光が微弱であり、VAMP-pHluorinを発現している終末を非活動時に形態的に同定するのが難しい、といった問題点が残されていた。造礁サンゴのDiscosoma種由来の蛍光タンパク質DsRedの改変体モノマーのひとつmOrangeは、pHluorinよりも長波長側に励起蛍光波長を持つ。本研究では、mOrangeのpH感受性を蛍光分光光度計で計測し、pKaを求めた。得られたpKaは7.1であり、mOrangeを用いることにより、S/Nが改良される可能性が示唆された。さらに、黄色蛍光タンパク質EYFPをドナー、mOrangeをアクセプターとするFRETによるレシオ型pHセンサーの作成を試みた。しかし、期待通りのFRETを得るには、リンカー部分の改善がさらに必要である。しかしVAMP-mOrange単独であっても、S/Nに改善が期待されるので、これを検証する目的で、VAMP-mOrangeをゲノムに導入したPC12細胞のin vivoの分泌システムを構築した。

Vamp-Phluorin（突触氟蛋白）是一种pH敏感的GFP修饰蛋白Phluorin，融合到突触囊泡膜蛋白VAMP-2（Synaptobrevin-2）的突触囊泡膜蛋白的C端侧。在胞吞作用和内吞作用过程中，突触囊泡管腔的pH从酸性（pH 5.6）变为中性变为酸性。突触氟蛋白方法通过改变作剂 - 氟蛋白的荧光来实时可视化囊泡动力学。与常规方法相比，通过突触氟蛋白方法的胞吐作用测量具有较高的灵敏度。 However, there have been problems such as (1) autofluorescence derived from endogenous flavone protein (FAD) during neuronal activity reduces the S/N of VAMP-pHluorin, and (2) the fluorescence of pHluorin in an acidic environment is weak, making it difficult to identify terminals expressing VAMP-pHluorin morphologically when inactive. Morange是荧光蛋白DSRED的变异单体之一，它源自礁石建造的珊瑚色圆盘种类，在比Phluorin较长的波长侧具有激发荧光波长。在这项研究中，使用荧光分光光度计测量了Morange的pH敏感性以确定PKA。获得的PKA为7.1，表明可以使用Morange改善S/N。此外，我们尝试使用FRET创建一个比例型pH传感器，该传感器将黄色荧光蛋白EYFP用作供体，将其作为受体。但是，需要进一步改进接头部分以实现预期的货物。但是，即使单独使用了鞋面 - 变形，也可以预期S/N的改进，因此，为了验证这一点，我们构建了已引入基因组的PC12细胞的体内分泌系统。