Xenopus卵を用いたDNA複製開始機構の研究

利用非洲爪蟾卵研究DNA复制启动机制

基本信息

批准号：
08277204
负责人：
室伏擴
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08277204/
关键词：
Xenopus卵 DNA複製 DNA複製開始因子 DNA untwisting因子 DNAヘリカーゼ

项目摘要

DNA Untwisting/Unwinding Factor(DUF)は、二重鎖DNAに負のひねりを加え、かつ二重鎖を巻き戻すことによって、in vitroでDNA複製を開始させる因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から単離された。この因子は、140kDaと96kDaの2種のサブユニット1:1から成る。これまでの研究で、96kDaサブユニット(DUF96)の全アミノ酸配列を決定し、これがマウスT160(V(D)J組換えのシグナル配列に結合する因子)およびヒトSSRP1(抗癌剤シスプラチン付加によって修飾されたDNAに結合する因子)と高い類似性を有することを明らかにした。本研究では、140kDaサブユニット(DUF140)の全アミノ酸配列を決定した。さらに、DUF140に対する抗体を作成し、DNA複製に対する効果を見た。(1)DUF140は出芽酵母のCDC68と約30%の類似性を持ち、N-末端近くには、DNAヘリカーゼモチーフと似た配列が、C-末端付近には酸性アミノ酸に富む部分と核移行シグナルと考えられる塩基性アミノの連続配列が存在することが分かった。(2)E.coli内で発現させたDUF140の部分フラグメントを抗原として、抗-DUF140抗体を作成した。この抗体を用いてXenopus卵無細胞抽出液からDUFを除くと、抽出液のDNA複製活性が顕著に減少することが分かった。また、この抗体を用いてXenopus培養細胞A6を染色すると、低密度で増殖中の細胞は、核が強く染色されたが、高密度の細胞では核の染色が減少することが分かった。このことは、DUF量が細胞増殖能と密接に関連することを示唆する。さらに、増殖中のA6細胞では、かなり顕著な核小体の染色が見られ、DUFが核小体中での転写にも関与する可能性が示唆された。

DNA Untwist/Undinding因子（DUF）对双链DNA具有负扭曲，作为通过将双链重新启动的DNA重复，从作者分离出双链。该因素由两种类型的亚基1：1、140KDA和96KDA组成。在先前的研究中，已经确定了96KDA亚基（DUF96）的总氨基酸序列，并且通过添加抗性的Chisplatin（小鼠T160的因素（v（d）J（d）j - j - j - j - v（d）J-修饰的信号序列）和人类SSRP1（添加了抗癌药物顺铂。已经表明它与与DNA结合的因子具有很高的相似性）。在这项研究中，确定了140KDA亚基（DUF140）所有氨基酸序列。此外，我们创建了DUF140的抗体，并看到了对DNA重复的影响。（1）DUF140的相似性约占出生的酵母CDC68的30％，并且在N端附近，该序列与DNA直升机Zematic相似，DNA直升机Zematic（C-End附近的面积核过渡信号发现有一系列连续的基本氨基。（2）用在大肠杆菌中以抗原表示的DUF140的部分片段产生抗DUF140抗体。使用该抗体，发现提取物的DNA繁殖显着降低，除了来自爪蟾卵细胞提取物的DUF。还发现，使用该抗体的染色爪蟾培养细胞A6具有很强的细胞核，该细胞在低密度下生长，但高密度细胞会降低核染色。这表明DUF量与细胞增殖密切相关。此外，在生长的A6细胞中，观察到了相当显着的核染色，这表明DUF可能与核中的转录有关。