Xenopus卵を用いたDNA複製開始機構の研究

利用非洲爪蟾卵研究DNA复制启动机制

基本信息

批准号：
08277204
负责人：
室伏擴
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08277204/
关键词：
Xenopus卵 DNA複製 DNA複製開始因子 DNA untwisting因子 DNAヘリカーゼ

项目摘要

DNA Untwisting/Unwinding Factor(DUF)は、二重鎖DNAに負のひねりを加え、かつ二重鎖を巻き戻すことによって、in vitroでDNA複製を開始させる因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から単離された。この因子は、140kDaと96kDaの2種のサブユニット1:1から成る。これまでの研究で、96kDaサブユニット(DUF96)の全アミノ酸配列を決定し、これがマウスT160(V(D)J組換えのシグナル配列に結合する因子)およびヒトSSRP1(抗癌剤シスプラチン付加によって修飾されたDNAに結合する因子)と高い類似性を有することを明らかにした。本研究では、140kDaサブユニット(DUF140)の全アミノ酸配列を決定した。さらに、DUF140に対する抗体を作成し、DNA複製に対する効果を見た。(1)DUF140は出芽酵母のCDC68と約30%の類似性を持ち、N-末端近くには、DNAヘリカーゼモチーフと似た配列が、C-末端付近には酸性アミノ酸に富む部分と核移行シグナルと考えられる塩基性アミノの連続配列が存在することが分かった。(2)E.coli内で発現させたDUF140の部分フラグメントを抗原として、抗-DUF140抗体を作成した。この抗体を用いてXenopus卵無細胞抽出液からDUFを除くと、抽出液のDNA複製活性が顕著に減少することが分かった。また、この抗体を用いてXenopus培養細胞A6を染色すると、低密度で増殖中の細胞は、核が強く染色されたが、高密度の細胞では核の染色が減少することが分かった。このことは、DUF量が細胞増殖能と密接に関連することを示唆する。さらに、増殖中のA6細胞では、かなり顕著な核小体の染色が見られ、DUFが核小体中での転写にも関与する可能性が示唆された。

作者从异爪蟾鸡蛋提取物中分离出DNA Untwist/Undinding因子（DUF），作为一个因子，作为一个因子，通过对双链DNA施加负转换并将双链重新启动，从而在体外启动DNA复制。该因素由两个亚基1：1、140 kDa和96 kDa组成。先前的研究已经确定了96KDA亚基（DUF96）的整个氨基酸序列，并表明它与小鼠T160具有很高的相似性（该因子与V（d）J重组的信号序列结合）和人类SSRP1的信号序列（通过添加抗Cantcancer Agentplatin Cisplatin Cissplatin Cissplatin）的信号序列和人类SSRP1（一个因子）。在这项研究中，确定了140 kDa亚基（DUF140）的整个氨基酸序列。另外，产生了针对DUF140的抗体，并观察到对DNA复制的影响。（1）发现DUF140与萌芽酵母的Cdc68的相似性约30％，并且在N末端附近的序列与DNA解旋酶基序相似，而在C末端附近，富含酸性氨基酸的酸性氨基酸和基本氨基酸含量为核转换信号的稳定序列。（2）使用以大肠杆菌为抗原表达的DUF140的部分片段制备抗DUF140抗体。已经发现，使用这种抗体从无爪蟾卵形提取物中去除DUF，提取物的DNA复制活性显着降低。此外，当用这种抗体染色爪蟾培养的细胞A6时，发现细胞核在低密度下生长的细胞中强烈染色，但是在高密度的细胞中核染色降低。这表明DUF量与细胞增殖电位密切相关。此外，在增殖A6细胞时观察到了相当明显的核仁染色，这表明DUF也可能参与核仁中的转录。