Xenipus卵を用いたDNA複製開始機構の研究

利用爪蟾卵研究DNA复制启动机制

基本信息

批准号：
09266201
负责人：
室伏擴
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09266201/
关键词：
Xenopus卵 DNA複製 DNA untwisting因子 SSRP1 Cdc68 p97ATPアーゼ

项目摘要

DNA Untwisting/Unwinding Factor(DUF)は、二重鎖DNAに負のひねりを加え、かつ二重鎖を巻き戻すことによって、in vitroでDNA複製を開始させる因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から単離された。DUFは、87kDaと140kDaとの2種のサブユニットから成り、前者はマウスT160(V(D)J組換えのシグナル配列に結合する因子)およびヒトSSRP1(シスプラチンによって修飾されたDNAに結合する因子)と高い類似性を有し、後者は、出芽酵母のG1期における遺伝子発現制御に関わるCdc68pと約30%の相同性を持つことを明らかにした。本研究では、Xenopus卵抽出液中でDUFが精子核に取り込まれる時期とDNA複製との時期の関係について調べた。さらに、Xenopus卵抽出液中に、DUFと相互作用する因子を探索した。(1)Xenopus卵抽出液に除膜した精子核を加えて、核形成、DUFおよびライセンシング因子であるMCMタンパク質の核への取り込み、また核におけるDNA複製の時期について検討した。その結果、MCMタンパク質が核形成直後に核に取り込まれるのに対し、DUFはDNA複製直前に核に取り込まれることがわかった。(2)抗-DUF140抗体を用いて、Xenopus卵抽出液中にDUFと結合する因子を探索したところ、分子量97kDaの因子が見いだされた。マイクロシークエンシングの結果、この因子はp97ATPアーゼであることがわかった。このATPアーゼは細胞質および核に存在し、細胞質では膜融合に関与することがわかっていたが、核内での機能は不明であった。DUFとp97ATPアーゼが相互作用することから、このATPアーゼがDUFとともにDNA複製に必要なDNAの構造変化に関与する可能性が示唆された。

DNA Untwist/Undinding因子（DUF）对双链DNA具有负扭曲，作为通过将双链重新启动的DNA重复，从作者分离出双链。 DUF由两种类型的亚单位组成，分别为87KDA和140KDA，前者是与DNA结合的因素（与小鼠T160结合的因素（V（d）J-修饰信号序列））和人类SSRP1（通过sisplatin修饰。它具有很高的相似性，后者揭示了它在胚芽酵母的G1相中与基因表达控制相关的Cdc68p约有30％。在这项研究中，我们研究了将DUF进口到异爪蟾卵提取物中的精子核与DNA复制之间的关系。此外，在爪蟾鸡蛋提取物中，探索了与DUF一起起作用的因子。（1）将过滤到爪蟾卵提取物的精子核添加到核形成时间，MCM蛋白的掺入，该蛋白是DUF和许可因子，以及在细胞核中DNA重复的时间。结果，发现在核形成后立即将MCM蛋白掺入细胞核中，而DUF则在DNA复制之前将其掺入细胞核中。（2）抗DUF140使用抗体探索与DUF结合的因子，并发现了97KDA的分子量。由于随后进行了微观寻求，因此发现该因素为P97ATP。在细胞质和细胞核中发现了ATP SO，众所周知，细胞质参与膜融合，但是核中的功能尚不清楚。 DUF与P97ATP AZE之间的相互作用表明，这种ATP可能与DNA复制所需的DNA的结构变化有关。