Xenopus卵を用いたDNA複製の制御機構に関する研究

利用非洲爪蟾卵研究DNA复制控制机制

基本信息

批准号：
06680575
负责人：
室伏擴
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.Xenopus卵のDUF(DNA untwisting/unwinding factor)の小サブユニット(96kDa)に対するモノクローン抗体を調整した。この抗体を用いた新しいXenopus DUFの精製法を確立した。2.DUFの小サブユニットに対する抗体を用いて、Xenopusの培養細胞A6を染色した。その結果、DUFは主として核に存在することがわかった。3.Xenopus卵抽出液に、除膜した精子頭部を添加すると、卵抽出液中のDUFは精子核と結合して、形成された核構造体中に取り込まれることがわかった。4.環状一本鎖DNAにオリゴヌクレオチドをアニールさせた基質を調整し、DUFの持つDNAヘリカーゼの性質を調べ、以下の結果を得た。オリゴヌクレオチドの3′端に一本鎖部分を持つ基質に対するヘリカーゼの活性は高かったが、5′端に一本鎖部分を持つ基質、および一本鎖部分を持たない基質に対する活性は低いことがわかった。このことから、DUFのDNAヘリカーゼの方向性はSV40のT-抗原の持つヘリカーゼとは逆に、5′端から3′端方向であることがわかった。DUFのDNAヘリカーゼはATPあるいはdATP存在下で活性を示し、他のNTPおよびdNTP存在下での活性は低かった。5.Xenopus DUFはcdc2/cyclinBおよびDNA依存プロテインキナーゼによってリン酸化され、特に、後者によってDNAヘリカーゼ活性が亢進することがわかった。6.Xenopus DUFの小サブユニットのcDNAクローニングを行い(現在進行中)、このサブユニットがHMGボックスを持つタンパク質であることを見いだした。7.DUFの小サブユニットに対する抗体を用いて、ラット腹水肝がんAH7974細胞からDUF類似タンパク質を精製した。その結果、AH7974細胞のDUF小サブユニット類似タンパク質はXenopusのものよりも小さい分子量(55kDa)を持ち、他の11種類のタンパク質と安定な複合体を形成していることがわかった。

1。单色抗体已调整为Xenopus egg DUF的小亚基（96KDA）（DNA Untwisting/Undinding系数）。已经建立了一种使用该抗体的新型Xenopus duf纯化方法。 2。使用DUF小亚基的抗体与染料爪蟾培养细胞A6。结果，发现DUF主要在核中发现。 3。当将排除的精子头添加到爪蟾鸡蛋提取物中时，已经发现，卵萃取中的DUF掺入了精子核中，并将其掺入形成的核结构中。 4。硬币形的单个链链调整了寡核苷酸的动画，检查了DNA解旋酶的性质，并获得了以下结果。在寡核苷酸末端具有单个链部分的底物的解旋酶的活性很高，但是在5'的末端具有单个链的底物的活性，而没有单个链的底物零件很低。这表明，DUF的DNA解旋酶的方向与SV40 T抗原的解旋酶相反，是3至3'末端方向。 DUF的DNA解旋酶在ATP或DATP的存在中表现出活性，并且在其他NTP和DNTP存在中较低。 5。Xenopusduf被Cdc2/cyclinb和DNA依赖性蛋白酶磷酸化，并且已经发现后者增强了DNA解旋酶活性。 6。我对爪诺司DUF小亚基（目前正在进行）进行了cDNA克隆，发现该亚单元是带有HMG盒的蛋白质。 7。使用DUF中的小亚成抗体，从大鼠腹水AH7974细胞中纯化了DUF样蛋白。结果，发现AH7974细胞DUF小亚基样蛋白的分子量（55KDA）比爪蟾较小，形成了其他11种蛋白质和稳定的复合物。