Xenopus卵を用いたDNA複製の制御機構に関する研究

利用非洲爪蟾卵研究DNA复制控制机制

基本信息

批准号：
06680575
负责人：
室伏擴
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.Xenopus卵のDUF(DNA untwisting/unwinding factor)の小サブユニット(96kDa)に対するモノクローン抗体を調整した。この抗体を用いた新しいXenopus DUFの精製法を確立した。2.DUFの小サブユニットに対する抗体を用いて、Xenopusの培養細胞A6を染色した。その結果、DUFは主として核に存在することがわかった。3.Xenopus卵抽出液に、除膜した精子頭部を添加すると、卵抽出液中のDUFは精子核と結合して、形成された核構造体中に取り込まれることがわかった。4.環状一本鎖DNAにオリゴヌクレオチドをアニールさせた基質を調整し、DUFの持つDNAヘリカーゼの性質を調べ、以下の結果を得た。オリゴヌクレオチドの3′端に一本鎖部分を持つ基質に対するヘリカーゼの活性は高かったが、5′端に一本鎖部分を持つ基質、および一本鎖部分を持たない基質に対する活性は低いことがわかった。このことから、DUFのDNAヘリカーゼの方向性はSV40のT-抗原の持つヘリカーゼとは逆に、5′端から3′端方向であることがわかった。DUFのDNAヘリカーゼはATPあるいはdATP存在下で活性を示し、他のNTPおよびdNTP存在下での活性は低かった。5.Xenopus DUFはcdc2/cyclinBおよびDNA依存プロテインキナーゼによってリン酸化され、特に、後者によってDNAヘリカーゼ活性が亢進することがわかった。6.Xenopus DUFの小サブユニットのcDNAクローニングを行い(現在進行中)、このサブユニットがHMGボックスを持つタンパク質であることを見いだした。7.DUFの小サブユニットに対する抗体を用いて、ラット腹水肝がんAH7974細胞からDUF類似タンパク質を精製した。その結果、AH7974細胞のDUF小サブユニット類似タンパク質はXenopusのものよりも小さい分子量(55kDa)を持ち、他の11種類のタンパク質と安定な複合体を形成していることがわかった。

1。针对异爪蟾卵中的小亚基（96 kDa）的单克隆抗体（96 kDa）。建立了一种使用该抗体纯化Xenopus duf的新方法。 2。培养的爪蟾细胞A6用针对DUF的小亚基的抗体染色。结果表明，DUFS主要存在于核中。 3。当将移除的精子头添加到爪蟾鸡蛋提取物中时，发现鸡蛋提取物中的DUF与精子核结合，并将其吸收到形成的核结构中。 4。通过将寡核苷酸退火为圆形的单链DNA制备，并检查了由DUF持有的DNA解旋酶的特性，并获得了以下结果。尽管在寡核苷酸3'末端具有单链部分的底物的解旋酶活性很高，但发现在5'端的单链部分的底物和没有单链部分的底物的底物很低。这表明DUF的DNA解旋酶的方向性与SV40的T-抗原的解旋酶相反。 DUF DNA解旋酶在ATP或DATP的存在下是活性，并且在其他NTP和DNTP的存在下的活性较低。 5。Xenopusduf被Cdc2/cyclinb和DNA依赖性蛋白激酶磷酸化，尤其是后者已发现可增强DNA解旋酶活性。 6。进行了Xenopus duf的小亚基（目前正在进行）的cDNA克隆，发现亚基是携带HMG盒的蛋白质。 7.DUFの小サブユニットに対する抗体を用いて、ラット腹水肝がんAH7974细胞からduf类似タンパク质を精制した。结果表明，AH7974细胞中的DUF小亚基样蛋白的分子量（55 kDa）比Xenopus较小，并与其他11种蛋白质形成稳定的复合物。