一分子蛍光イメージングを用いたヒトDNA複製開始因子の動態解明

使用单分子荧光成像阐明人类 DNA 复制起始因子的动态

基本信息

批准号：
20J00572
负责人：
伊藤優志
金额：
$ 2.58万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

当該年度は、DNA二重鎖の塩基対間に挿入する分子である、インターカレーターで細胞を処理したときの、クロマチンの動きの変化を調べた。初めに、Haloタグで標識したヒストンH2Bを発現する細胞を作製した。作製した細胞を蛍光色素TMRが結合したHaloTagリガンドで処理することで、ヌクレオソームを蛍光で標識した。斜光照明顕微鏡を用いてレーザー光を細胞に照射し、蛍光標識ヌクレオソームから放出された蛍光をCMOSカメラで検出した。トラッキングアルゴリズムを用いてヌクレオソームの運動を自動追跡し、運動の速さの指標となる平均二乗変位を定量的に求めた。細胞をインターカレーターの一種であるドキソルビシンで処理すると、クロマチンの動きが抑制された。また、クロマチンの動きはドキソルビシンの濃度依存的に抑制された。異なるインターカレーターである、ダウノマイシンとアクチノマイシンDで細胞を処理した場合も同様に、クロマチンの運動が減少した。したがって、クロマチンの運動の抑制は一般的なインターカレーターに共通の性質であると考えられる。続いて、インターカレーターによるクロマチン運動の抑制が可逆的な反応かどうか検証した。ドキソルビシンで処理した細胞を液体培地で洗浄することで、ドキソルビシンを除いた。ドキソルビシン除去後、時間依存的にクロマチンの運動が増加し、7時間で処理前の状態に戻った。したがって、ドキソルビシンによるクロマチンの運動の抑制は、可逆的な反応であると考えられる。また、生細胞内のTopBP1タンパク質の運動を追跡し、各軌跡の拡散係数を定量的に求めた。その結果、拡散係数の値の分布が2成分から成ることが分かった。速い拡散の成分は細胞核内を拡散するTopBP1分子に対応し、遅い拡散の成分はクロマチンに結合したTopBP1に対応すると考えられる。

今年，我们研究了用嵌入剂（一种插入 DNA 双链碱基对之间的分子）处理细胞时染色质运动的变化。首先，生成表达用 Halo 标签标记的组蛋白 H2B 的细胞。通过用与荧光染料 TMR 结合的 HaloTag 配体处理制备的细胞，对核小体进行荧光标记。使用倾斜照明显微镜用激光照射细胞，并使用 CMOS 相机检测从荧光标记的核小体发出的荧光。使用跟踪算法，我们自动跟踪核小体的运动并定量确定均方位移，这是运动速度的指标。当细胞用阿霉素（一种嵌入剂）处理时，染色质运动受到抑制。此外，染色质运动以阿霉素浓度依赖性方式受到抑制。用不同的嵌入剂、道诺霉素和放线菌素 D 处理细胞，同样会减少染色质运动。因此，抑制染色质运动被认为是一般嵌入剂共有的性质。接下来，我们验证了嵌入剂对染色质运动的抑制是否是可逆反应。通过用液体培养基洗涤阿霉素处理的细胞来去除阿霉素。去除阿霉素后，染色质运动以时间依赖性方式增加，并在 7 小时内恢复到治疗前状态。因此，阿霉素对染色质运动的抑制被认为是可逆反应。我们还追踪了 TopBP1 蛋白在活细胞内的运动，并定量确定了每个轨迹的扩散系数。结果发现，扩散系数值的分布由两个分量组成。据认为，快速扩散成分对应于在细胞核内扩散的TopBP1分子，而慢速扩散成分对应于与染色质结合的TopBP1。