一分子蛍光イメージングを用いたヒトDNA複製開始因子の動態解明

使用单分子荧光成像阐明人类 DNA 复制起始因子的动态

基本信息

批准号：
19K23735
负责人：
伊藤優志
金额：
$ 1.83万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-08-30 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

当該年度は、一分子蛍光顕微鏡を用いてヌクレオソームの動きを追跡した。具体的には、Haloタグを修飾したヒストンタンパク質H2Bを持つ細胞を作製し、その細胞に蛍光色素を加えることで、ヌクレオソーム一分子を蛍光で可視化した。RNAの転写がヌクレオソームの運動に与える影響を検証するために、転写に関わるメディエータータンパク質複合体を分解した。初めに、ヒトHCT116細胞を使用し、オーキシンという薬剤に応答してメディエータータンパク質を分解するシステムを持つ細胞を作製した。その細胞を使用し、メディエータータンパク質の一つであるMED14を分解したところ、ヌクレオソームの動きがわずかに増加した。しかし、その増加幅は、転写阻害剤を使用した実験のものよりも小さかった。この結果から、クロマチンの架橋に対するメディエータータンパク質複合体の寄与は小さいということが示唆された。一方、HCT116細胞は、核のサイズに対して占める核小体の割合が大きいために、ヌクレオソームの動きの変化が小さかった可能性も考えられた。そのため、現在、別の細胞であるヒトDLD-1細胞を使用し、メディエータータンパク質を分解するシステムを持つ細胞を作製している。また、DLD-1細胞においても、転写阻害剤で細胞を処理したり、RNAポリメラーゼを分解したりすることで、転写が阻害されてヌクレオソームの動きが顕著に増加することを確認した。

在今年，使用单分子荧光显微镜跟踪核小体运动。具体而言，产生了带有用晕hal晕修饰的组蛋白H2b的细胞，并通过向细胞添加荧光染料，通过荧光可视化一个单个核小体分子。为了验证RNA转录对核小体运动的影响，降解了参与转录的介体蛋白复合物。首先，使用人类HCT116细胞来产生细胞，该系统会响应一种称为生长素的剂，从而降解介质蛋白。使用细胞Med14（介质蛋白之一）降解，从而导致核小体运动略有增加。但是，增加的增加比使用转录抑制剂的实验小。结果表明，介质蛋白复合物对染色质交联的贡献很小。另一方面，相对于核仁的大小，HCT116细胞可能具有很大比例的核酸，这可能会导致核小体运动的小变化。因此，我们目前正在使用另一个细胞人类DLD-1细胞来创建用降解介质蛋白的系统创建细胞。还可以证实，在DLD-1细胞中，通过用转录抑制剂和降解RNA聚合酶处理细胞来抑制转录并显着增加核小体运动。