がん細胞の二重鎖DNAひねり因子の構造と機能に関する研究

癌细胞中双链DNA扭曲因子的结构与功能研究

基本信息

批准号：
10152209
负责人：
室伏擴
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10152209/
关键词：
Xenopus卵 DNA複製 SSRP1 Cdc68 HMGタンパク質 p97ATPアーゼクロマチン

项目摘要

DUFは、二重鎖DNAに結合して二重鎖に負のひねりを加えることによって、二重鎖を局部的に開く活性を持つ因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から初めて精製された。DUFは、出芽酵母のCdc68の類似体とSSRP1(シスプラチンによって修飾されたDNAに結合する因子)とのへテロ二両体である。S期のXenopus卵無細胞抽出液に、精子クロマチンあるいはプラスミドDNAを添加すると、これらを鋳型としてDNA複製が起こる。この系を用いて、DNA複製におけるDUFの機能を解析した。抗-DUF抗体を用いて、卵抽出液からDUFを除くと、精子クロマチンを鋳型としたDNA複製活性が著しく減少した。これに精製DUFを加えると、複製能の回復が見られた。このことはDUFが卵抽出液におけるDNA複製に必須であることを示す。精子クロマチンを卵抽出液に加えると、クロマチンの膨潤に次いで核形成が起き、DNA複製が行われる。卵抽出液中のDUFは核形成時あるいはそれ以後、かつ、DNA複製開始以前に核に取り込まれ、クロマチンと結合することがわかった。抗-DUF抗体を用いた沈降実験により、p97ATPaseがDUFと相互作用するということがわかった。また、p97 ATPaseもDUFとほぼ同じ時期に、再構成された核に取り込まれた。DUF存在下で再構成されたクロマチンDNAは、非存在下のクロマチンDNAよりもヌクレアーゼ感受性が高いことが判明した。さらに、DUFはヒストンに対して強い親和性を示した。DUFはDNAおよびコアヒストンと相互作用して、DNA複製に必要なゆるんだクロマチン構造を作る作用を持つということが示唆される。HeLa cDNAライブラリーからヒトDUF140のクローニングを行っ結果、ヒトとXenopusのDUF140のアミノ酸配列は86%保存されていることがわかった。

作者首先从非洲爪蟾卵提取物中纯化出 DUF，作为一种因子，该因子具有通过与双链 DNA 结合并使其负向扭曲而局部打开双链 DNA 的活性。 DUF 是芽殖酵母 Cdc68 类似物和 SSRP1（一种与顺铂修饰的 DNA 结合的因子）的异二聚体。当精子染色质或质粒 DNA 添加到 S 期非洲爪蟾卵的无细胞提取物中时，DNA 复制就会以它们为模板进行。使用该系统，我们分析了 DUF 在 DNA 复制中的功能。当使用抗 DUF 抗体从卵子提取物中去除 DUF 时，以精子染色质为模板的 DNA 复制活性显着降低。当向其中添加纯化的DUF时，复制能力得以恢复。这表明 DUF 对于鸡蛋提取物中的 DNA 复制至关重要。当精子染色质添加到卵子提取物中时，染色质会膨胀并随后成核，从而导致 DNA 复制。发现鸡蛋提取物中的 DUF 在成核期间或之后以及 DNA 复制开始之前掺入细胞核并与染色质结合。使用抗 DUF 抗体的沉降实验表明 p97ATPase 与 DUF 相互作用。 p97 ATPase 也与 DUF 大约同时掺入重建的细胞核中。发现在 DUF 存在的情况下重建的染色质 DNA 比在 DUF 不存在的情况下重建的染色质 DNA 对核酸酶更敏感。此外，DUF 对组蛋白表现出很强的亲和力。结果表明，DUF 与 DNA 和核心组蛋白相互作用，形成 DNA 复制所需的松散染色质结构。从 HeLa cDNA 文库克隆人类 DUF140 表明，人类和非洲爪蟾 DUF140 的氨基酸序列有 86% 的保守性。