Xenopus卵を用いたDNA複製開始機構の研究

利用非洲爪蟾卵研究DNA复制启动机制

基本信息

批准号：
10162202
负责人：
室伏擴
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10162202/
关键词：
Xenopus卵 DNA複製 SSRP1 Cdc68 HMGタンパク質クロマチン

项目摘要

DUFは二重鎖DNAに結合して、二重鎖に負のひねりを加えることによって、二重鎖を局部的に開く活性を持つ因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から初めて精製された。DUFは、出芽酵母のCdc68の類似体とSSRP1(シスプラチンによって修飾されたDNAに結合する因子)とのヘテロ二両体である。精製DUFを、種々のニックを持たない弛緩した環状二重鎖DNA溶液に加えると、二重鎖DNAに負のひねりが導入された。また、ひねりの導入にはATPは必要なかった。pSV00CAT DNA(4.6kbp)を用いて、DUF量とひねり数との量的関係を調べたところ、0.9pmolのDUFが、0.07pmolのDNAに負のひねり1つを導入することがわかった。このことは、1分子のDNAを1回ひねりるためには、約13分子のDUFが必要であるということを意味する。Xenopus卵抽出液に環状一本鎖M13DNAを加えると、それを鋳型としてDNA合成が行われ、形成された二重鎖にヒストンが結合してクロマチン構造が作られることが知られている。DUF存在下(mock処理卵抽出液中)および非存在下(抗-DUF抗体でDUFを除いた卵抽出液中)で形成させたクロマチンに対するミクロコッカスヌクレアーゼ感受性を調べたところ、DUF存在下のクロマチンDNAは、非存在下のクロマチンDNAよりもヌクレアーゼ感受性が高いことがわかった。また、ヒストンを固定化したカラムを用いてDUFとヒストンとの相互作用を調べたところ、DUFはヒストンに対して強い親和性を持つことがわかった。DUFはDNAのみならず、コアヒストンとも相互作用して、DNA複製に必要なゆるんだクロマチン構造を作る作用を持つということが示唆される。

首先，通过与双链DNA结合并对双链体施加负扭转，首先，由异爪蟾鸡蛋提取物中的作者纯化为具有局部开放活动的因素。 DUF是从发芽酵母和SSRP1的Cdc68类似物的杂质形式（该因子结合了通过顺铂修饰的DNA）。将纯化的DUF添加到没有各种痕迹的放松的圆形双链DNA溶液中，并将负扭转引入双链DNA中。此外，不需要ATP引入转折。使用PSV00CAT DNA（4.6 kbp），我们研究了DUF和Twist数量之间的定量关系，发现0.9 pmol的DUF将一个负转换引入了0.07 pmol的DNA中。这意味着大约需要大约13个DUF来扭动一个DNA分子。众所周知，当将圆形的单链M13 DNA添加到爪蟾鸡蛋提取物中时，使用该圆形鸡蛋提取物作为模板进行DNA合成，并且组蛋白与形成的双链结合以形成染色质结构。在存在DUF（在模拟处理的鸡蛋提取物中）形成的染色质的微球菌对染色质的敏感性（在没有抗DUF抗体的鸡蛋提取物中）在存在DUF的情况下比染色质DNA更具核酸酶敏感性。此外，当使用与固定组蛋白的色谱柱研究DUF与组蛋白之间的相互作用时，发现DUF对组蛋白具有很强的亲和力。建议DUF不仅与DNA相互作用，而且与核心组蛋白相互作用，从而产生了DNA复制所需的松散染色质结构。