Xenopus卵を用いたDNA複製開始機構の研究

利用非洲爪蟾卵研究DNA复制启动机制

基本信息

批准号：
10162202
负责人：
室伏擴
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10162202/
关键词：
Xenopus卵 DNA複製 SSRP1 Cdc68 HMGタンパク質クロマチン

项目摘要

DUFは二重鎖DNAに結合して、二重鎖に負のひねりを加えることによって、二重鎖を局部的に開く活性を持つ因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から初めて精製された。DUFは、出芽酵母のCdc68の類似体とSSRP1(シスプラチンによって修飾されたDNAに結合する因子)とのヘテロ二両体である。精製DUFを、種々のニックを持たない弛緩した環状二重鎖DNA溶液に加えると、二重鎖DNAに負のひねりが導入された。また、ひねりの導入にはATPは必要なかった。pSV00CAT DNA(4.6kbp)を用いて、DUF量とひねり数との量的関係を調べたところ、0.9pmolのDUFが、0.07pmolのDNAに負のひねり1つを導入することがわかった。このことは、1分子のDNAを1回ひねりるためには、約13分子のDUFが必要であるということを意味する。Xenopus卵抽出液に環状一本鎖M13DNAを加えると、それを鋳型としてDNA合成が行われ、形成された二重鎖にヒストンが結合してクロマチン構造が作られることが知られている。DUF存在下(mock処理卵抽出液中)および非存在下(抗-DUF抗体でDUFを除いた卵抽出液中)で形成させたクロマチンに対するミクロコッカスヌクレアーゼ感受性を調べたところ、DUF存在下のクロマチンDNAは、非存在下のクロマチンDNAよりもヌクレアーゼ感受性が高いことがわかった。また、ヒストンを固定化したカラムを用いてDUFとヒストンとの相互作用を調べたところ、DUFはヒストンに対して強い親和性を持つことがわかった。DUFはDNAのみならず、コアヒストンとも相互作用して、DNA複製に必要なゆるんだクロマチン構造を作る作用を持つということが示唆される。

作者首先从非洲爪蟾卵提取物中纯化出 DUF，作为一种因子，该因子具有通过与双链 DNA 结合并使其负向扭曲而局部打开双链 DNA 的活性。 DUF 是芽殖酵母 Cdc68 类似物和 SSRP1（一种与顺铂修饰的 DNA 结合的因子）的异二聚体。当纯化的 DUF 添加到各种无切口的松弛环状双链 DNA 溶液中时，双链 DNA 中会引入负扭曲。此外，引入扭曲不需要 ATP。当我们使用 pSV00CAT DNA (4.6 kbp) 研究 DUF 的量和扭转次数之间的定量关系时，我们发现 0.9 pmol 的 DUF 会在 0.07 pmol 的 DNA 中引入 1 个负扭转。这意味着大约需要 13 个 DUF 分子才能扭转一个 DNA 分子一次。众所周知，当将环状单链 M13 DNA 添加到非洲爪蟾卵提取物中时，会以其为模板进行 DNA 合成，组蛋白与形成的双链结合，形成染色质结构。当我们研究存在（模拟处理的鸡蛋提取物）和不存在（用抗 DUF 抗体去除 DUF 的鸡蛋提取物）时形成的染色质的微球菌核酸酶敏感性时，我们发现在 DUF DNA 存在的情况下染色质发现在不存在的情况下对核酸酶比染色质 DNA 更敏感。此外，当我们使用组蛋白固定柱研究 DUF 和组蛋白之间的相互作用时，我们发现 DUF 对组蛋白具有很强的亲和力。这表明 DUF 不仅与 DNA 相互作用，还与核心组蛋白相互作用，以创建 DNA 复制所需的松散染色质结构。