がん細胞のDNA複製における二重鎖DNAひねり因子の機能に関する研究

双链DNA扭曲因子在癌细胞DNA复制中的作用研究

基本信息

批准号：
12215033
负责人：
室伏擴
金额：
$ 2.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12215033/
关键词：
HeLa細胞 Xenopus卵 DNA複製 SSRP1 Cdc68 FACT クロマチン HMGタンパク質

项目摘要

申請者らは、ツメガエル卵抽出液からDNA複製開始に必要なDNAひねり因子を精製した。この因子は、分子量140kDa(Cdc68タンパク質の類似体)と87kDa(hSSRP1の類自体)のポリペプチド鎖から成り、二重鎖DNAに負のねじれを導入する活性を持つ。本研究では、培養ヒトがん細胞のDNAひねり因子の発現と精製を行い、二重鎖DNAおよびヌクレオソームの構造に対する影響を調べる。さらに、DNAひねり因子と相互作用する因子を探索し、これら因子の、細胞のがん化に伴う動態と機能の変化を調べる。以上の実験により、がん細胞のDNA複製機構の特異性を明らかにすることを目的とした。DNAひねり因子の140kDaサブユニットにHisタグを付加したクローンと、hSSRP1のクローンをバキュロウイルスに組み込み、両サブユニットを共発現させ、Niキレートカラム、SP、およびHAカラムを用いて精製した。今後、クロマチン構造をとったSV40 DNAのin vitroでの複製に対するDNAひねり因子の作用を解析する予定である。両サブユニットに対する抗体を用いて、HeLa細胞とヒト二倍体繊維芽細胞を染色したところ、核全体、特に、核小体が染色された。HeLa細胞から単離された核にはDNAひねり因子が結合しており、高塩濃度溶液によって抽出された。抗体を用いてDNAひねり因子を除いたツメガエル卵抽出液中で形成されたクロマチンと、DNAひねり因子を含む卵抽出液中で形成されたクロマチンとに対するヌクレアーゼ感受性を調べたところ、前者よりも後者のほうが感受性が高かった。さらに、精製DNAひねり因子は、二重鎖DNAのみならず、ヒストンを固定化させたカラムに結合した。以上の結果から、DNAひねり因子は、DNAおよびヒストンに結合してクロマチン構造をゆるめ、DNA複製が起こりやすくする働きがある考えられる。

申请人纯化了从爪蟾卵提取物中引发DNA复制所需的DNA扭曲因子。该因子由一个多肽链组成，其分子量为140 kDa（CDC68蛋白的类似物）和87 kDa（HSSRP1类本身），并且具有将负扭转引入双链DNA中的活性。在这项研究中，我们将在培养的人类癌细胞中表达和纯化DNA扭曲因子，并研究对双链DNA和核小体结构的影响。此外，随着细胞癌的转化，我们搜索与DNA扭曲因子相互作用的因素，并研究这些因素的动力学和功能的变化。上述实验用于阐明癌细胞的DNA复制机制的特异性。将其标签的克隆添加到DNA扭曲因子的140 kDa亚基中，并将HSSRP1的克隆集成到杆状病毒中，并使用Ni Chelate柱，SP和HA柱共表达并纯化两个亚基。将来，我们将分析DNA扭曲因子对具有染色质结构的SV40 DNA体外复制的影响。针对两个亚基的抗体都用于染色HeLa细胞和人二倍成纤维细胞，以及整个核，尤其是核仁。从HeLa细胞分离的细胞核与DNA扭曲因子结合，并用高盐溶液提取。当检查对在Xenopus卵提取物中形成的染色质的核酸酶敏感性时，这些提取物已使用抗体去除并在含有DNA扭曲因子的卵提取物中形成的染色质时，后者比前者更敏感。此外，纯化的DNA扭曲因子不仅与双链DNA结合，还与组蛋白固定的柱结合。基于上述结果，据信DNA扭曲因子与DNA和组蛋白结合，使染色质结构松开，从而使DNA复制更容易发生。