カリクレインによる血中で生成されるPGI_2生産促進ペプチドの分離同定と作用機構

激肽释放酶血液中PGI_2促产肽的分离鉴定及作用机制

基本信息

批准号：
01637503
负责人：
室田誠逸
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-01637503/
关键词：
プロスタサイクリン PGI_2 血管内皮細胞カリクレイン

项目摘要

カリクレインはセリンプロチア-ゼであり血清中のキニノ-ゲンを基質としてリジルブラディキニン、ブラディキニンを産生する酵素である。私達はカリクレインのウシ動脈由来内皮細胞におけるプロスタサイクリン(PGI_2)合成促進作用が、前述したキニンの生産を介さず、新規ペフチドを産生する可能性を見い出した。血管内皮細胞にカリクレインを長時間作用させるとそのPGI_2合成促進作用は少なくとも24時間は持続した。しかし反応途中で細胞層を洗うか、もしくはカリクレインの阻害剤を加えるとそのPGI_2合成促進効果が失われた。したがって、新規ペプチドはカリクレインにより常に産生されながらPGI_2合成促進作用を発揮していると考えられる。本度はこの新規ペプチドの構造決定を試みた。血清の硫安沈殿を行い、40〜50%飽和画分にカリクレインを加え37℃で1時間インキュベ-トした。反応液をセントリコン-10にかけて遠心分離し、低分子画分をさらにHPLCを用いて分画した。カリクレイン処理によって新たに出現した5つのピ-クについて、それぞれさらにHPLCを用いて精製した。それぞれはアミノ酸4〜7個から成るペプチドであった。それらの構造決定を行ったのち、新規にそれぞれのペプチドを化学合成し、その活性を調べたが、活性は保持されていなかった。おそらく硫安分画時にプロテア-ゼも濃縮され、一部消化されてしまったためと思われた。さらに工夫をこらし、精製を行っている段階である。血管内皮細胞においてカリクレインによるPGI_2合成の促進効果は、タンパク合成阻害剤では抑制されないがブランディキニンのそれは抑制されることから、本ペプチドとブランディキニンの作用機作は本質的に異なるものと思われる。

激肽释放酶是一种丝氨酸蛋白酶，利用血清中的激肽原作为底物产生赖氨缓激肽和缓激肽。我们发现激肽释放酶促进牛动脉内皮细胞中前列环素（PGI_2）合成的能力可能会产生一种新的肽，而无需产生上述激肽。当激肽释放酶长期作用于血管内皮细胞时，其促进PGI_2合成的作用可持续至少24小时。然而，如果在反应过程中洗涤细胞层或添加激肽释放酶抑制剂，则会失去PGI_2合成促进作用。因此，认为新型肽在由激肽释放酶不断产生的同时发挥促进PGI_2合成的作用。这次，我们试图确定这种新肽的结构。将血清进行硫酸铵沉淀，并将激肽释放酶添加到40-50%饱和级分中，并在37℃下孵育1小时。使用Centricon-10离心反应溶液，并使用HPLC进一步分级分离低分子量级分。使用 HPLC 进一步纯化激肽释放酶处理后新出现的 5 个峰。每个都是由 4 到 7 个氨基酸组成的肽。在确定其结构后，重新化学合成了每种肽并研究了其活性，但活性并未保留。这可能是因为蛋白酶在硫酸铵分级分离过程中也被浓缩并被部分消化。我们目前正处于进一步细化、细化的阶段。激肽释放酶对血管内皮细胞PGI_2合成的促进作用不被蛋白质合成抑制剂抑制，但白兰地激肽则被抑制，因此认为该肽与白兰地激肽的作用机制有本质的不同。