糖尿病性血管障害に関する研究,血清中プロスタサイクリン産生刺激因子の基礎と臨床

糖尿病血管病、血清前列环素产生刺激因子的基础和临床研究

基本信息

批准号：
01570646
负责人：
梅田文夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至 1991
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01570646/
关键词：
PGI_2産生刺激因子性状精製線維芽細胞培養液血管内皮細胞糖尿病性血管障害一線維芽物細胞培養液血清プロスタサイクリン産生刺激活性硫酸アンモニウムイオン交換クロマトグラフィ-ヘパリンクロマトグラフィ-アンチトロンビンIII

项目摘要

血管内皮細胞より産生されるプロスタサイクリン(PGI_2)は、強力な血管拡張作用および血小板凝集抑制作用を有する。MacintyreらはPCI_2の産生を刺激する活性が流血中に存在することを報告しているが、その本態因子はいまだ不明である。我々は、培養ウシ血管内皮細胞による生物学的測定系を用い、流血中に本活性の存在を認め、しかも本活性の低下が糖尿病性血管障碍や動脈硬化症の発症、進展に関連している成績を報告してきた。一方、近年種々の生理活性物質が細胞の培養上清より精製されている。我々は、ヒト二倍体線維芽細胞の無血清培養上清(conditroned medium CM)中にPGI_2産生刺激活性を認め、本活性因子(PGI_2 production stimulating factor PSF)の精製を行った。約50L(総蛋白量2g)のCMを濃縮し、蛋白量1mg/mlに調整した。Wators社のHPLC装置に装着したDBAEー5PW(21.5×15)、HEPARINー5PW(7.5×7.5)、PROTEINーPAK300×2の各種HPLC用columnを用い、活性分画を粗精製した。SDSーPAGE上、非還元下でPSFは31kDaの単一バンド、還元下で35、27、8kDaのバンドとして認められた。31kDa蛋白をG4 reverseーphaseHPLCで分析すると、アセトニトリル濃度28%と31%の位置に2種類の蛋白が混在していることが判明した。アミノ酸シ-クエンサ-でそれぞれのN末端アミノ酸配列を分析した。Homology検索の結果、一方はinsulinーlike growth factor(IGF)binding protein4と相同性が高いことが判明した。そこで、IGFー1に対するligandーaffinity columnを作製した。PSF活性はIGFー1 ligand affinity columnのflowーthrough分画に認められた。この分画をC4 reverseーphaseHPLCで分析すると、アセトニトリル濃度31%の位置に単一ピ-クとして認められた。従って、PSFはこの新しい蛋白と推定されている。現在分子生物学的手法を用いてPSFの構造を決定中である。

血管内皮细胞产生的前列环素（PGI_2）具有较强的舒血管和抑制血小板聚集作用。 Macintyre等人报道，血液中存在刺激PCI_2产生的活性，但其关键因素仍不清楚。使用使用培养的牛血管内皮细胞的生物测量系统，我们检测到血流中存在这种活性，此外，我们发现这种活性的减少与糖尿病血管疾病和动脉硬化的发生和进展有关。报告了我的结果。另一方面，近年来，已从细胞培养上清液中纯化出各种生理活性物质。我们在人二倍体成纤维细胞的无血清培养上清液（CM）中发现了PGI_2产生刺激活性，并纯化了该活性因子（PGI_2产生刺激因子PSF）。将约50μL（总蛋白量：2g）的CM浓缩，并将蛋白量调整至1mg/ml。使用连接至 Wators HPLC 装置的 DBAE-5PW (21.5 x 15)、HEPARIN-5PW (7.5 x 7.5) 和 PROTEIN-PAK300 x 2 的各种 HPLC 柱粗纯化活性级分。在 SDS-PAGE 上，在非还原条件下观察到 PSF 为 31 kDa 的单条带，在还原条件下观察为 35、27 和 8 kDa 的条带。通过 G4 反相 HPLC 对 31kDa 蛋白质的分析表明，两种类型的蛋白质在乙腈浓度为 28% 和 31% 时共存。使用氨基酸测序仪分析每个N-末端氨基酸序列。同源性检索结果发现，其中之一与胰岛素样生长因子（IGF）结合蛋白4具有高度同源性。因此，我们创建了 IGF-1 的配体亲和柱。在 IGF-1 配体亲和柱的流通部分中观察到 PSF 活性。当通过C4反相HPLC分析该级分时，在乙腈浓度31%处观察到单峰。因此，推测PSF就是这种新蛋白质。我们目前正在使用分子生物学方法确定 PSF 的结构。