培養系による中枢神経細胞の傷害機序とその制御に関する研究

利用培养系统研究中枢神经细胞损伤机制及其控制

基本信息

批准号：
03263207
负责人：
室田誠逸
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03263207/
关键词：
神経細胞グルタミン酸神経細胞死 NMDA 海馬

项目摘要

興奮性アミノ酸による神経細胞障害は、虚血性脳障害、頭部外傷などの中枢性疾患に深く関与しているが、そのメカニズムはいまだ仮説の域を出ない。我々は独自の神経細胞培養系を用いて新しい神経細胞死判定系を開発すると共に、薬剤による神経細胞死の予防に関する検討を試みた。神経細胞の培養には胎児脳からのPrinsary cultureを使用せざるを得ないが、常にin vivoとの対比が問題となる。興奮性アミノ酸の影響を検討する際にはその受容体の発現が重要であるため、可及的長期の培養が必要である。このためにはグリア細胞との共存が必要である。我々はグリア細胞の上にカバ-グラスを置きその上に胎児脳細胞を蒔くことにより、2週間前後に渡る神経細胞優位の培養を可能とした。この培養系を用いて興奮性アミノ酸による神経細胞障害を調べる目的で,画像解析装置付き蛍光顕微鏡ACASー507による新しい神経細胞死判定系の開発を試みた。既に神経細胞死は色素排除法や培養液中の酵素測定などによって判定されているが、迅速性、正確性などいくつかの問題点が指摘されている。我々は蛍光発色に生細胞内エステラ-ゼを必要とする蛍光色素FDA、及び細胞膜障害に伴って細胞内に入り蛍光を獲得するPIを用いて上述の問題点を解決した。これにより、数分以内での正確な神経細胞死の判定が可能となった。上述の判定系を用いて新しく合成された薬剤の効果判定を行ったところ、興奮性アミノ酸投与後における処理開始にも有効性が認められた。Fura‐2を用いた細胞内カルシウム測定によって細胞内カルシウム流入の阻害がその作用機序であろうと推測された。以上の様に本assay系は神経細胞死判定のみならず、治療薬の開発、神経細胞死に至るメカニズムの解明に大きな役割を果たすことが期待される。

兴奋性氨基酸引起的神经细胞损伤与缺血性脑损伤、头部外伤等中枢性疾病有密切关系，但其机制目前还只是一种假设。我们利用独特的神经元培养系统开发了一种新的神经元死亡测定系统，并尝试研究通过药物预防神经元死亡。尽管必须使用胎儿大脑的原代培养物来培养神经细胞，但与体内的比较始终是一个问题。在检查兴奋性氨基酸的作用时，其受体的表达很重要，因此需要尽可能长时间地培养。为此，必须与神经胶质细胞共存。通过将盖玻片放在神经胶质细胞顶部并在顶部播种胎儿脑细胞，我们能够将以神经元为主的细胞培养约两周。为了使用该培养系统研究兴奋性氨基酸引起的神经元损伤，我们尝试使用配备图像分析仪的荧光显微镜 ACAS-507 开发一种新的神经元死亡测定系统。神经元细胞死亡已经通过染料排除方法和培养液中的酶测量来确定，但已经指出了一些问题，包括速度和准确性。我们通过使用荧光染料FDA（需要活细胞中的酯酶才能发出荧光）和PI（当细胞膜受损时进入细胞并获得荧光）解决了上述问题。这使得在几分钟内准确确定神经细胞死亡成为可能。当使用上述评价系统评价新合成药物的有效性时，发现在给予兴奋性氨基酸后开始治疗时也是有效的。使用 Fura-2 进行的细胞内钙测量表明其作用机制可能是抑制细胞内钙内流。如上所述，该检测系统预计不仅在确定神经细胞死亡方面发挥重要作用，而且在开发治疗药物和阐明导致神经细胞死亡的机制方面也将发挥重要作用。