ペルオキシソームの形成と機能発現制御を司るPEX遺伝子システムの解明

阐明控制过氧化物酶体形成和功能表达的 PEX 基因系统

基本信息

批准号：
12206069
负责人：
藤木幸夫
金额：
--
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

1)私たち独自に分離したCHO変異細胞ZPG208に対しラットcDNA libraryを用いた機能相補活性スクリーニング法によりペルオキシソームの形成異常を相補するPEX3遺伝子のクローニングに成功した。ついでZPG208細胞と同じ相補性群であるペルオキシソーム欠損症相補性群G群の患者由来細胞にPEX3を発現させたところペルオキシソームの形成障害が相補された。さらにこの患者細胞のPEX3遺伝子をRT-PCR法により解析したところ、1塩基置換によるエクソン11の欠質をホモ接合型として有しており,この変異型PEX3は相補活性を有していないところから、PEX3がG群の病因遺伝子であると結論した。またPEX3遺伝子変異細胞ではペルオキシソームの膜形成にも異常を有することから、ZPG208細胞は膜形成の分子機構を解明するうえでも有用性が高い。2)私たちは、PTS1レセプターであるPex5pには哺乳動物系ではアイソフォーム、Pex5pSおよびPex5pL(S型内部に37アミノ酸配列の挿入が認められる)が存在することを先に見出している。両者の機能に関し、新たに分離した特異的表現型(PTS2タンパク質の輸送のみに異常を示すが変異遺伝子はPTS1レセプターをコードするPEX5であった)を示すCHO変異細胞ZPG231の分子細胞生物学解析から、PTS1タンパク質輸送に関わる一方、Pex5pLはPTS2タンパク質の輸送をPTS2レセプターPex7pと結合することにより担っていることを見出した。またこれらのカーゴ・レセプター複合体はPex14p,Pex13pを主体とした膜透過装置を経てペルオキソーム内へ局在化されることも見出した。今後これら諸因子を用いることにより膜透過過程の詳細な解析が可能になると考えられる。3)ペルオキシソーム膜透過装置の構成因子の一つと考えられるPex12pについて、まずPEX12異常CHO変異細胞ZP104およびZP109の変異部位を決定、ついでPex12pの構造と機能に関し検討した結果、C-末端部に存在する亜鉛フィンガーRINGはPex12pの機能に必須であることを明らかにした。またPex12pは他のペルオキシンPex5p,Pex10pなどと相互作用することも見出した。今後、カーゴタンパク質のオルガネラマトリックス側での解離機構や両レセプターの細胞質へのシャトル機構などの解明が待たれる。

1）我们利用独立分离的CHO突变细胞ZPG208中的大鼠cDNA文库，采用功能互补活性筛选方法，成功克隆了与过氧化物酶体畸形互补的PEX3基因。接下来，当我们在过氧化物酶体缺陷补充组G（与ZPG208细胞相同的补充组）的患者来源的细胞中表达PEX3时，过氧化物酶体形成的缺陷得到了补充。此外，当通过RT-PCR分析该患者细胞的PEX3基因时，发现其在外显子11处由于单核苷酸取代而出现纯合性缺失，并且这种突变的PEX3不具有互补活性，因此得出PEX3的结论。是G组的致病基因。此外，由于PEX3基因突变细胞在过氧化物酶体膜形成方面也存在异常，因此ZPG208细胞对于阐明膜形成的分子机制非常有用。 2）我们之前发现PTS1受体Pex5p存在于哺乳动物亚型Pex5pS和Pex5pL中（在S形式中插入了37个氨基酸序列）。关于这两种功能，对CHO突变细胞ZPG231进行分子细胞生物学分析，该细胞显示出新分离的特定表型（仅在PTS2蛋白的转运中表现出异常，但突变基因是编码PTS1受体的PEX5，发现Pex5pL参与其中）。 PTS1 蛋白转运，而 Pex5pL 通过与 PTS2 受体 Pex7p 结合负责 PTS2 蛋白转运。我们还发现这些货物受体复合物通过主要由 Pex14p 和 Pex13p 组成的膜渗透装置定位到过氧化物酶体中。人们认为，通过使用这些因素，未来对膜渗透过程的详细分析将成为可能。 3）对于被认为是过氧化物酶体膜透化装置的组成部分之一的Pex12p，我们首先确定了PEX12异常CHO突变细胞ZP104和ZP109中的突变位点，然后研究了Pex12p的结构和功能，发现我们发现锌指环对于 Pex12p 的功能至关重要。我们还发现 Pex12p 与其他过氧化物酶（例如 Pex5p 和 Pex10p）相互作用。未来，我们期待阐明细胞器基质侧货物蛋白的解离机制以及两种受体到细胞质的穿梭机制。