ペルオキシソーム形成因子群の膜インターフェイス機能と制御

膜界面功能和过氧化物酶体形成因子的调节

基本信息

批准号：
17048020
负责人：
藤木幸夫
金额：
$ 4.29万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は以下の研究項目に取り組み、分子レベルでの成果を得ることができた。1)Pex14pの機能領域と分子動態の解析膜局在ペルオキシンPex14pに関し、機能領域21-260の同定と共に、ペルオキシソーム膜上にてPex14p-Pex13p複合体として存在、PTS1タンパク質-Pex5p複合体をリクルートし、ついでPTS1タンパク質はペルオキシソーム膜内に取り込まれ、Pex5pは結合しているPex14p複合体から解離再び細胞質へとリサイクルされ、その後Pex14pは再び他のPex14pおよびPex13pと結合し複合体を形成することを見出した。2)ペルオキシソームの分裂・形態制御機構正常な球形ではなく繊維状に伸びたペルオキシソームを表現型とするCHO変異細胞ZP121では、その原因がダイナミン様タンパク質DLP1遺伝子の点突然変異によりGTPase活性を失ったことに起因すること、すなわちDLP1がペルオキシソームの形態形成にも関わっていること、ZP121が世界で初めての哺乳動物dlp1変異細胞であることを見出した。さらに、DLP1の膜上レセプターであるFis1もペルオキシソーム膜上に存在していることを見出した。この両者に、ペルオキシソームの分裂に必須なPex11pを加えた3者の協奏的作用により、ペルオキシソームの分裂と形態が制御されていることも最近明らかにした。3)Pex19pによるペルオキシソーム膜タンパク質の輸送と膜形成機構ペルオキシソーム膜タンパク質のPex19pによるin vitro局在化アッセイ系の確立に続いて、Pex19pは新規合成膜タンパク質と細胞質中で複合体を形成、安定化し,次いで経時的に膜形成に依存して輸送,局在化させることを、ペルオキシソーム膜欠損性pex19CHO変異細胞ZP119を用いて明らかにした。4)AAA ATPaseファミリーPex1pならびにPex6pとその複合体のペルオキシソームへのリクルーターPex26pとのダイナミズム解析Pex1pとPex6pのWalker motifs変異解析を含めた分子解剖とPex1p、Pex6pそれぞれの活性領域、さらには両者複合体形成必須領域を明らかにした。加えて、Pex26pとの3者複合体形成能とその生理的意義を明らかにした。また、細胞質のPex1pのオリゴマー体を検討、3量体ならびに6両体として存在することも見出した。新たな温度感受性pex1変異CHO細胞株の分離に成功した。5)PTS2受容体Pex7pによるマトリクスPTS2タンパク質の輸送機構PTS2タンパク質はPTS2受容体であるWD motif-rich Pex7pによって認識され、PTS1受容体Pex5pL依存的にペルオキシソームに輸送される。今回、活性を有するrecombinant Pex7pの発現と精製に成功、Pex5pL,輸送装置因子Pex14pやPex13pなどを用いて輸送各ステップの詳細を明らかにした。

今年，我们能够解决以下研究项目并在分子水平上取得结果。 1）分析膜中PEX14P的功能区域和分子动力学局部定位的过氧蛋白PEX14P，我们发现，与鉴定功能区域21-260的鉴定，PTS1蛋白PEX5P复合物在过氧化物膜膜上存在于PEX14P-P-PEX13P复合物，并募集了PTS5P，PTS1蛋白PEX5P复合物在进入过氧化物酶体膜，然后再次与结合的PEX14P复合物分离到细胞质中，然后PEX14P再次与其他PEX14P和PEX13P结合，形成复合物。 2) Peroxisome division and morphology control mechanism In CHO mutant cell ZP121, which phenotypes peroxisomes that are extended fibrously rather than normal spherical shape, we found that the cause was due to loss of GTPase activity due to a point mutation in the dynamin-like protein DLP1 gene, that is, DLP1 is also involved in peroxisome morphogenesis, and that ZP121 is the world's first哺乳动物DLP1突变细胞。此外，已经发现，在过氧化物酶体膜上也存在FIS1，一种DLP1的上膜受体。最近还揭示了过氧化物酶体分裂和形态受到PEX11P的三向协同作用的调节，PEX11p对过氧化物酶体分裂至关重要。 3）在建立了过氧化物酶体蛋白的体外定位测定系统后，PEX19P通过PEX19P通过PEX19P传输和膜形成机制，PEX19P形成并稳定在细胞质中的复合物，并使用新型的合成膜蛋白和embrane formities termintors在其中进行稳定，然后将其定位为embrane formist，然后将其定位为embrane-fime，并在孟布尔蛋白质中进行定位。缺乏膜的PEX19CHO突变细胞ZP119。 4）对AAA ATPase家族，PEX1P及其复杂的招募者PEX26P对过氧化物体的动态分析，分子解剖结构，包括PEX1P和PEX6P中Walker Motifs突变的分析，以及PEX1P和PEX6P的活性区域，以及两种复合物的基本区域。另外，阐明了具有PEX26P及其生理意义的三方复合物的能力。此外，我们研究了细胞质区域PEX1P的低聚形式，发现它是一种三聚体和六个特征的存在 Tert。新型温度敏感的PEX1突变体CHO细胞系已成功分离。 5）PTS2受体PEX7P的矩阵PTS2蛋白的转运机制PTS2蛋白被PTS2受体WD富含PEX7P识别，并在PTS1受体PEX5PL依赖性方式中运输到过氧化物酶体中。在本文中，我们成功地表达并纯化了主动重组PEX7P，并使用PEX5PL和运输设备因子PEX14P和PEX13P阐明了每个传输步骤的详细信息。