ペルオキシソーム形成および細胞機能の制御:ペルオキシン群の分子機能と動態

过氧化物酶体形成和细胞功能的控制：过氧化物酶基团的分子功能和动力学

• 批准号: 17028042
• 负责人: 藤木 幸夫
• 金额: $ 5.38万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17028042/
• 关键词: ペルオキシソーム; CHO変異細胞; ペルオキシソーム形成因子; 膜形成; 膜透過機構; ペルオキシソーム欠損症

本年度は以下の研究項目に取り組み、分子レベルでの成果を得ることができた。1)Pex14pの機能領域と分子動態の解析膜局在ペルオキシンPex14pに関し、機能領域21-260の同定と共に、ペルオキシソーム膜上にてPex14p-Pex13p複合体として存在、PTS1タンパク質-Pex5p複合体をリクルートし、ついでPTS1タンパク質はペルオキシソーム膜内に取り込まれ、Pex5pは結合しているPex14p複合体から解離再び細胞質へとリサイクルされ、その後Pex14pは再び他のPex14pおよびPex13pと結合し複合体を形成することを見出した。2)Pex19pによるペルオキシソーム膜タンパク質の輸送と膜形成機構ペルオキシソーム膜タンパク質のPex19pによるin vitro局在化アッセイ系の確立に続いて、Pex19pは新規合成膜タンパク質と細胞質中で複合体を形成、安定化し,次いで経時的に膜形成に依存して輸送,局在化させることを、ペルオキシソーム膜欠損性pex19 CHO変異細胞ZP119を用いて明らかにした。3)AAA ATPaseファミリーPex1pならびにPex6pとその複合体のペルオキシソームへのリクルーターPex26pとのダイナミズム解析Pex1pとPex6pのWalker motifs変異解析を含めた分子解剖とPex1p、Pex6pそれぞれの活性領域、さらには両者複合体形成必須領域を明らかにした。加えて、Pex26pとの3者複合体形成能とその生理的意義を明らかにした。また、細胞質のPex1pのオリゴマー体を検討、3量体ならびに6両体として存在することも見出した。新たな温度感受性pex1変異CHO細胞株の分離に成功した。4)PTS2受容体Pex7pによるマトリクスPTS2タンパク質の輸送機構PTS2タンパク質はPTS2受容体であるWD motif-rich Pex7pによって認識され、PTSI受容体Pex5pL依存的にペルオキシソームに輸送される。今回、活性を有するrecombinant Pex7pの発現と精製に成功、Pex5pL,輸送装置因子Pex14pやPex13pなどを用いて輸送各ステップの詳細を明らかにした。5)ペルオキシソームの分裂・形態制御機構正常な球形ではなく繊維状に伸びたペルオキシソームを表現型とするCHO変異細胞ZP121では、その原因がダイナミン様タンパク質DLP1遺伝子の点突然変異によりGTPase活性を失ったことに起因すること、すなわちDLP1がペルオキシソームの形態形成にも関わっていること、ZP121が世界で初めての哺乳動物dlp1変異細胞であることを見出した。さらに、DLP1の膜上レセプターであるFis1もペルオキシソーム膜上に存在していることを見出した。この両者に、ペルオキシソームの分裂に必須なPex11pを加えた3者の協奏的作用により、ペルオキシソームの分裂と形態が制御されていることも最近明らかにした。

今年，我们开展了以下研究项目，并取得了分子水平的成果。 1) Pex14p 的功能区和分子动力学分析 对于膜定位的过氧化物蛋白 Pex14p，随着功能区 21-260 的鉴定，它以 Pex14p-Pex13p 复合物的形式存在于过氧化物酶体膜上，并招募 PTS1 蛋白- Pex5p 复合物之一。我们发现PTS1蛋白被吸收到过氧化物酶体膜中，Pex5p从结合的Pex14p复合物中解离并循环到细胞质，然后Pex14p再次与其他Pex14p和Pex13p结合形成复合物。 2) Pex19p 的过氧化物酶体膜蛋白转运和膜形成机制在建立过氧化物酶体膜蛋白 Pex19p 的体外定位测定系统后，Pex19p 与细胞质中新合成的膜蛋白形成并稳定复合物接下来，我们证明了转运。定位取决于使用过氧化物酶体膜缺陷的 pex19 CHO 突变细胞 ZP119 随着时间的推移膜的形成。 3) AAA ATPase家族Pex1p和Pex6p及其与过氧化物酶体募集剂Pex26p的复合物的动态分析Pex1p和Pex6p的分子解剖，包括Walker基序突变分析、Pex1p和Pex6p的活性区域以及两者的复合物。明确了形成区域。此外，我们还阐明了与Pex26p形成三元复合物的能力及其生理意义。我们还检查了细胞质中 Pex1p 的寡聚形式，发现它同时以三聚体和六角寡聚体的形式存在。我们成功分离出一种新的温度敏感 pex1 突变 CHO 细胞系。 4)PTS2受体Pex7p对基质PTS2蛋白的转运机制 PTS2蛋白被PTS2受体、富含WD基序的Pex7p识别，并以依赖于PTSI受体Pex5pL的方式转运至过氧化物酶体。这次，我们成功表达和纯化了活性重组Pex7p，并阐明了使用Pex5pL和转运因子Pex14p和Pex13p的每个转运步骤的细节。 5）过氧化物酶体分裂/形态控制机制在CHO突变细胞ZP121中，过氧化物酶体表型是丝状过氧化物酶体而不是正常的球形。其原因是由于动力蛋白样中的点突变导致GTPase活性丧失。我们发现DLP1也参与过氧化物酶体形态发生，ZP121是世界上第一个哺乳动物dlp1突变细胞。此外，我们发现 Fis1（DLP1 的膜受体）也存在于过氧化物酶体膜上。最近的研究表明，过氧化物酶体的分裂和形态是由这两者加上Pex11p的协同作用控制的，而Pex11p对于过氧化物酶体的分裂至关重要。

项目成果

Peroxisome division is impaired in a CHO cell mutant with an inactivating point-mutation in cynain-like protein 1 gene

青霉素样蛋白 1 基因失活点突变的 CHO 细胞突变体中过氧化物酶体分裂受损

• 发表时间: 2006
• 期刊: Experimental Cell Research (in press)
• 作者: Tanaka;A. et al.
• 通讯作者: A. et al.

In vitro transport of membrane proteins to peroxisomes by shuttling receptor Pex19p

• DOI: 10.1074/jbc.m509819200
• 发表时间: 2006-01-06
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Matsuzono, Y;Fujiki, Y
• 通讯作者: Fujiki, Y

Dynamic and Functional Assembly of the AAA Peroxins, Pex1p and Pex6p, and Their Membrane Receptor Pex26p

AAA 过氧化物酶、Pex1p 和 Pex6p 及其膜受体 Pex26p 的动态和功能组装

• 发表时间: 2006
• 期刊: The Journal of Biological Chemistry 281(38)
• 作者: Tamura;S. et al.
• 通讯作者: S. et al.

Lessons from peroxisome-deficient Chinese hamster ovary (CHO) cell mutants

• DOI: 10.1016/j.bbamcr.2006.09.012
• 发表时间: 2006-12-01
• 期刊: BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-MOLECULAR CELL RESEARCH
• 影响因子: 5.1
• 作者: Fujiki, Yukio;Okumoto, Kanji;Ghaedi, Kamran
• 通讯作者: Ghaedi, Kamran

Peroxisome division is impaired in a CHO cell mutant with an inactivating point-mutation in dynamin-like protein 1 gene

动力蛋白 1 基因失活点突变的 CHO 细胞突变体中过氧化物酶体分裂受损

• 发表时间: 2006
• 期刊: Experimental Cell Research 312(9)
• 作者: Tanaka;A. et al.
• 通讯作者: A. et al.