発生・形態形成の個体レベルにおける分子生物学的研究

个体发育和形态发生水平的分子生物学研究

基本信息

批准号：
08NP0401
负责人：
竹市雅俊
金额：
--
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Creative Basic Research
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ショウジョウバエの神経系で発現するカドヘリンを2種類同定し、その解析を進めた。その一つDN-カドヘリンの変異体を調べた結果、中枢神経系における軸索の走行パターンに種々の乱れが認められ、その過程における必須の役割が証明された。もう一方の分子は以外にも7回膜貫通ドメインを有し、その変異個体では中枢神経系の繊維束に断絶が生じており、シグナル伝達に関わる重要な役割が示唆された。また、昨年度に得られたカドヘリン-11のノックアウトマウスの解析の結果、脳の局所的な異常が認められた。2.新たな神経-筋認識候補分子として、leucine-rich repeat遺伝子ファミリーに属する膜貫通型蛋白質P750をクローニングした。この分子は神経-筋結合の特異性に関連し、特定の運動神経細胞、筋肉において発現することから、神経の遊走、標的認識に関与している可能性が高いと判断された。3.網膜分化を誘導するHLH型因子としてATH-3とMashlが、抑制因子としてHES1が同定された。また、これら以外にもHLH型因子であるHES5が網膜に発現していた。したがって、網膜分化は少なくとも4種類のHLH型因子によって誘導あるいは抑制されており、これらの因子がバランス良く機能することによって眼の形態形成が進められることが示された。4.予定細胞死領域となっている第3指間から指間間充織を取り出し、培養系でのBMPの作用を解析した。この培養系に様々なTGFβファミリー蛋白質を添加すると、アクチビンやTGFβでは細胞数に変化は起きないが、BMP-2,BMP-4では細胞死が引き起された。指間間充織細胞に、あらかじめドミナントネガティブレセプターをウィルスベクターを用いて導入しておくと、BMP-2,BMP-4に対して抵抗性を示した。これらの事実はBMP-2,BMP-4がプログラム細胞死の特異的メディエーターとなっていることを強く支持する。5.転写因子Islet-3のLIM領域のみをゼブラフィッシュ胚で過剰発現させ、内因性Islet-3の機能を抑制する実験を行った。その結果、眼胞の欠失、視蓋及び小脳への区分化の阻害、中脳・後脳境界部での細胞死による小脳原基の低形成がおきた。さらに、LIM過剰発現胚では、中脳・後脳境界部におけるWntlの発現が消失し、その後にEn2とPax2の発現も失われることが分かった。これらの結果から、中脳及び中脳・後脳境界領域の分化においてIslet-3は、Wntlを分泌する過程の維持に必須であることなどが示唆された。6.神経系特異的RNA結合性蛋白質をコードするmouse-musashi-1に関してノックアウトマウス作製に成功した。詳細な表現型の解析を通して、本遺伝子産物の哺乳類中枢神経系幹細胞の非対称的分裂における役割を検討中である。7.エピブラストから始原生殖細胞が誘導される分子機構を明らかにする目的で、エピブラスト内の予定始原生殖細胞領域で発現する遺伝子のクローニングをめざし、EG細胞-ES細胞のサブトラクションクローニングを試みた。その結果、EG細胞で特異的に発現する16種類の遺伝子断片を得ることに成功した。さらに、原腸陥入前の胚から単離したエピブラストから始原生殖細胞が誘導される初代培養系を確立することに成功した。以上の他にも、多くの業績をあげることができた。

1。确定了在果蝇神经系统中表达的两种类型的钙粘蛋白，并进行了分析。 DN-钙粘着蛋白的突变体之一表明，在中枢神经系统的轴突延伸模式中发现了各种疾病，这在过程中表现出了重要的作用。另一个分子还具有七个跨膜结构域，在突变个体中，中枢神经系统的纤维束中发生了分解，这表明在信号传导中起重要作用。此外，对去年获得的Cadherin-11敲除小鼠的分析显示局部脑异常。 2。属于富含亮氨酸的重复基因家族的跨膜蛋白P750被克隆为神经肌肉识别的新候选分子。该分子与神经肌肉结合的特异性有关，并在特定的运动神经元和肌肉中表达，因此很可能参与神经元迁移和靶标识别。 3。ATH-3和MASHL被鉴定为诱导视网膜分化的HLH型因子，而HES1为抑制剂。除此之外，在视网膜中也表达了HLH型因子Hes5。因此，已经表明，至少四种HLH型因子诱导或抑制了视网膜分化，并且这些因素的平衡功能促进了眼形态发生。 4。从第三根手指（即计划的细胞死亡区域）中除去二牙间间隙，并分析了BMP在培养系统中的影响。当将各种TGFβ家族蛋白添加到该培养系统中时，在激活素或TGFβ中不会改变细胞的数量，但是细胞死亡是在BMP-2和BMP-4中引起的。使用病毒载体将显性阴性受体引入二型间充质细胞中，并表现出对BMP-2和BMP-4的耐药性。这些事实强烈支持BMP-2和BMP-4是程序性细胞死亡的特定介体。 5。实验仅表达斑马鱼胚胎中转录因子胰岛3的LIM区域，以抑制内源性胰岛3的功能。结果，眼睑的缺失，抑制分裂为粘胶和小脑的抑制以及小脑原始的发育不全是由中脑和后脑边界的细胞死亡引起的。此外，发现在LIM表达的胚胎中，WNTL在中脑脑边界上的表达丢失了，其次是EN2和PAX2的表达。这些结果表明，Islet-3对于维持在中脑和中脑/后脑边界区域分化WNTL的过程中至关重要。 6。敲除小鼠成功地用于小鼠 - 穆萨西1，该小鼠编码神经系统特异性的RNA结合蛋白。通过详细的表型分析，目前正在研究该基因产物在哺乳动物中枢神经系统干细胞不对称分裂中的作用。 7。为了阐明从层细胞诱导原始生殖细胞的分子机制，我们尝试将EG-ES细胞的克隆扣除克隆，目的是克隆eG-ES细胞的基因，以克隆eg-eS细胞的克隆。结果，我们成功获得了在EG细胞中特异性表达的16种类型的基因片段。此外，我们已经成功建立了一个原发性培养系统，在该系统中，从胃前胚胎中分离出的尤其细胞诱导原始生殖细胞。除上述内容外，还取得了许多其他成就。