新規E3ユビキチンリガーゼファミリーによるトラフィック制御機構の解明

新型 E3 泛素连接酶家族阐明交通控制机制

• 批准号: 18050041
• 负责人: 石戸 聡
• 金额: $ 3.84万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18050041/
• 关键词: ユビキチン; B7-2; ユビキチンリガーゼ; 細胞内輪送; 蛋白分解; リソソーム; 抗原提示細胞; 免疫制御; エンドサイトーシス; MHC class II; MHC class I

本期間にて、新規E3ユビキチンリガーゼファミリーメンバーであるc-MIRによる細胞内輸送機構を詳細に検討した。まず、c-MIRがドキシサイクリン(Dox)にて誘導的に発現出来る細胞T-REx-c-MIRを作成した。この細胞にて、Dox添加、約4時間後にc-MIRの発現を観察する事が出来る。さらに、ユビキチン化をモニターするためにFLAGタグを挿入したCD8キメラ分子をT-REx-c-MIR細胞に導入した。この標的分子はFLAG抗体にて精製し、生化学的解析を行う事が出来る。さらに、細胞表面におけるイベントを詳細に検討するため、細胞表面をビオチン化し解析を行った。その結果、Dox添加後、約4時間で表面に存在していたCD8キメラ分子がユビキチン化される事が明らかとなった。さらに、ユビキチン化が表面において誘導され、internalizationのシグナルとなりうるのかを、クロルプロマジン(CPZ)にてinternalizationを抑制する事にて検討した。CPZ処理にて細胞表面のユビキチン化されたキメラ分子は集積し、分解が抑制された。キメラ分子の細胞内領域リジン残基に変異を導入したユビキチン化を受けない分子はinternalizeされなかった。最終的に、T-REx-c-MIRにsiRNAを用いて、E2酵素がUBCH5b/cである事を同定し、細胞表面におけるユビキチン化を抑制した結果、CD8キメラ分子はinternalizationされなかった。これらの結果から、c-MIRによる標的分子の抑制は、細胞表面におけるユビキチン化を誘導し、internalizationを誘起する事により起っている事が明らかとなった。この結果は2008年のPLoS ONEに掲載された。

在此期间，我们详细研究了c-MIR（一种新型E3泛素连接酶家族成员）的细胞内转运机制。首先，我们创建了 T-REx-c-MIR，这是一种可以通过多西环素 (Dox) 诱导表达 c-MIR 的细胞。在这些细胞中，添加 Dox 后约 4 小时可观察到 c-MIR 表达。此外，为了监测泛素化，将插入 FLAG 标签的 CD8 嵌合分子引入 T-REx-c-MIR 细胞中。可以使用 FLAG 抗体纯化该靶分子并进行生化分析。此外，为了详细检查细胞表面的事件，我们对细胞表面进行了生物素化并对其进行了分析。结果显示，添加 Dox 后约 4 小时，表面存在的 CD8 嵌合分子被泛素化。此外，我们研究了表面是否诱导泛素化，并且可以通过用氯丙嗪（CPZ）抑制内化来作为内化信号。泛素化嵌合分子在细胞表面积累，并且通过 CPZ 处理抑制其降解。未通过将突变引入嵌合分子胞内区域的赖氨酸残基而进行泛素化的分子不会内化。最后，使用 T-REx-c-MIR 的 siRNA，我们将 E2 酶鉴定为 UBCH5b/c 并抑制细胞表面的泛素化，但结果是 CD8 嵌合分子没有内化。这些结果表明，c-MIR 通过诱导细胞表面泛素化并诱导内化来抑制靶分子。结果于 2008 年发表在 PLoS ONE 上。

项目成果

c-MIRを利用したCD40の発現調節、及びそのスクリーニング方法

c-MIR的CD40表达调控及其筛选方法

• 发表时间: 2007

樹状細胞の分化に重要な役割を持つMARCEH-I分子

MARCEH-I分子在树突状细胞分化中发挥重要作用

• 发表时间: 2007
• 作者: Nomura-Takigawa;Y.;Nagano-Fujii;M.;Deng;L.;Kitazawa;S.;Ishido.S.;Sada;K.;Hotta;H.;後藤 栄治;石戸 聡;星野 真理
• 通讯作者: 星野 真理

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスMIR1,2の哺乳類相同分子の同定

卡波西肉瘤相关疱疹病毒 MIR1,2 的哺乳动物同源物的鉴定

• 发表时间: 2007
• 作者: 石戸 聡;後藤 栄治;水戸 麻理;青木 雅美;松木 洋平;星野 真理;植松 未香
• 通讯作者: 植松 未香

主要組織適合抗原の新たな制御分子群

主要组织相容性抗原的新调控组

• 发表时间: 2007
• 作者: 後藤 栄治;星野 真理;松木 洋平;水戸 麻理;青木 雅美;植松未香;石戸 聡
• 通讯作者: 石戸 聡

New players for regulation of MHC function

MHC功能调节的新参与者

• 发表时间: 2007
• 作者: 石戸 聡;後藤 栄治;水戸 麻理;青木 雅美;松木 洋平;星野 真理;植松 未香;Ishido S . ,Hoshino M . ,Goto E . ,Aoki M . ,Matsuki Y . ,Yoshida M . ,and Uematsu M
• 通讯作者: Ishido S . ,Hoshino M . ,Goto E . ,Aoki M . ,Matsuki Y . ,Yoshida M . ,and Uematsu M