ヒト癌組織における抗原ペプチド産生能に関する基礎的研究

人类癌组织产生抗原肽能力的基础研究

• 批准号: 17016081
• 负责人: 鵜殿 平一郎
• 金额: $ 4.99万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17016081/
• 关键词: プロテアソーム; 癌組織; hsp90; 抗原プロセシング

微量のヒト癌組織からオーダーメイドにプロテアソームを分離精製する事を可能にした。1,リコンビナント-ヒトhsp90α、の発現・精製を行った。2,2例のヒト癌組織からのライセートの調整およびプロテアソームのin vitroアッセンブリ;大腸癌及び周囲の正常組織約0.1〜0.6cm^3から細胞ライセートを作製し、hsp90αを加えて、プロテアソームのアッセンブリを行った。3,アッセンブリされたプロテアソームの精製系の確立;1、におけるリコンビナント蛋白は全て6xヒスチジンタグをそのN末側にもつ。Ni^<2+>アガロースでpull downし、これをnative-PAGEで分離しsuc-LLVY-amc及びboc-LRR-amcの加水分解活性を指標に活性を検出した(In-Gel hydrolysis assay)。4,native-PAGEゲルをニトロセルロース膜に転写し、特異的抗体を用いてプロテアソームの構造解析を行った。結果)0.1cm^3ほどのヒト癌組織又はその周囲の正常組織より酵素活性を有したプロテアソームを再構成し、分離精製できた。得られたプロテアソームはハイブリッド型とホモPA28型が主体であり、キモトリプシン様活性を有していた。しかし、トリプシン様活性は正常組織より回収したホモPA28型プロテアソームで極めて高いのに対し、癌からの活性は微弱であった。また、品質管理E3ユビキチンリガーゼと呼ばれるCHIPが両方の組織のホモPA28型プロテアソームに会合していた。20Sコアについては、正常組織ではXタイプ優位のスタンダード型が、癌組織では免疫プロテアソームのタイプが優位であった。以上より極微量(〜0.1cm^3)の凍結癌組織からhsp90αを用いてプロテアソーム再構成を促し、精製分離できることが明らかにされた。これらのプロテアソームを用いて癌ペプチド前駆体の切断実験が可能と判断された。

这使得从微量人类癌症组织中定制分离和纯化蛋白酶体成为可能。 1.重组人hsp90α的表达和纯化。 2、两例人癌组织裂解液的制备及蛋白酶体的体外组装；取约0.1～0.6cm^3的结肠癌组织及周围正常组织制备细胞裂解液，加入hsp90α，进行蛋白酶体组装。 。 3. 组装蛋白酶体纯化系统的建立； 步骤1中的所有重组蛋白的N端均带有6x组氨酸标签。用Ni 2+ 琼脂糖下拉，通过非变性-PAGE分离，并以suc-LLVY-amc和boc-LRR-amc的水解活性为指标检测活性(In-Gel水解测定)。 4.将native-PAGE凝胶转移到硝酸纤维素膜上，使用特异性抗体分析蛋白酶体的结构。结果：我们能够从约 0.1 cm^3 的人类癌症组织或周围正常组织中重建、分离和纯化具有酶活性的蛋白酶体。获得的蛋白酶体主要为杂合型和同型PA28型，且具有胰凝乳蛋白酶样活性。然而，从正常组织中回收的同型 PA28 型蛋白酶体中，胰蛋白酶样活性极高，而来自癌症的活性则较弱。此外，CHIP（一种质量控制 E3 泛素连接酶）与两种组织中的同型 PA28 型蛋白酶体相关。对于20S核心，在正常组织中以X型为主的标准型为主，在癌组织中以免疫蛋白酶体型为主。综上所述，hsp90α可用于促进蛋白酶体重建并纯化和分离微量（~0.1cm^3）的冷冻癌组织。已确定可以使用这些蛋白酶体对癌症肽前体进行切割实验。

项目成果

プロテアソームの再構成方法

如何重建蛋白酶体

• 发表时间: 2005