B細胞抗原受容体を介した細胞内情報伝達と免疫寛容の分子機構

B细胞抗原受体介导的细胞内信号转导和免疫耐受的分子机制

基本信息

批准号：
06265207
负责人：
山梨裕司
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06265207/
关键词：
チロシンキナーゼ遺伝子欠損マウス Src lgn HS1

项目摘要

1.抗原受容体刺激直後にチロシリン酸化される主要な基質として、転写因子様配列、核移行シグナル様の配列、ならびにSH3配列を有する蛋白質p75^<HS1>を固定した。p75^<HS1>は渡辺らが樹立したHS1欠損マウスの解析から、Bリンパ球のApoptosisに関わることが明らかとなっており、そのリン酸化機構を解析することは重要である。そこで、B細胞抗体受容体に会合するLynやSykをp75^<HS1>と共にCV1細胞で高発現させた。その結果p75^<HS1>のリン酸化は、LynあるいはSyk単独では殆ど起こらず、LynとSyk共存下で、起こることが明らかとなった。そしてp75^<HS1>の2つのチロシン残基(Y378とY397)が、これらキナーゼによってリン酸化される部位であることを、Y378FならびにY397F変異体や両チロシン残基を含む配列を欠失する変異体を作成することによって示した。更に、CVI細胞での高発現系を用いて、リン酸化に伴うp75^<HS1>の局在の変化を調べ、非リン酸化状態のp75^<HS1>が細胞質に局在するのに対し、LynとSykの協調によりリン酸化されたp75^<HS1>は核に移行しうることを示した。従ってB細胞に於て抗原受容対刺激に伴い、p75^<HS1>はチロシンリン酸化され、少なくともその一部は核に移行して、Apoptosis等の生理機能に関与すると考えられる。2.lyn遺伝子欠損マウス樹立のためにゲノム解析のlyn遺伝子の単離を試み、その過程でlyn遺伝子が少なくとも2コピー存在することを明らかにした。hnRNAを鋳型としたRT-PCR法、およびそれぞれのコピーのエクソンの塩基配列とcDNAの塩基配列の比較により、このうちの一つが転写される機能lyn遺伝子であることを示した。次いで機能lyn遺伝子のエクソン3にneo遺伝子を組み込んだターゲティングベクターを構築し、ES細胞内での相同組み換えを経て、lyn遺伝子をホモに欠損するマウスを作成した。得られたlyn遺伝子欠損マウスは、外見上の発達成育及び行動に特に異常を呈していない。脾臓B細胞ではsIgM架橋による細胞内蛋白質のチロシンリン酸化に著しい減弱が見られた。今後更に、B細胞の増殖能、Apoptosisi反応等についてlyn欠損マウスを用いて解析を行う予定である。

1。刺激抗原受体后立即被氧化酪氨酸的主要底物固定在转录因子序列中，核转变信号的序列和具有SH3序列的蛋白质p75^<hs1>。 P75^<hs1>从渡边等人建立的HS1缺陷小鼠的分析中揭示了p75^<hs1>，分析磷酸化机制很重要。因此，符合B细胞抗体受体的Lyn和Syk与P75^<hs1>一起在CV1细胞中高度表达。结果，p75^<hs1>的磷酸化很少出现在Lyn或Syk中，并且发现Lyn和Syk共存发生。 p75^<hs1>两个酪氨酸残基（Y378和Y397）是这些激酶磷酸化的部分，Y378F，Y397F突变体和两个酪氨酸残基被删除。此外，使用CVI细胞中的高生成系统，检查了与磷酸化相关的局部变化，而非磷酸化的p75^<hs1>位于p75^<hs1>中通过Lyn和Syk的配位磷酸化，表明它可能是核。因此，在B细胞中，p75^<hs1>被认为是酪氨酸蛋白氧化的，至少一部分生理功能，例如凋亡，至少是p75^<hs1>的一部分。 2。缺乏基因组的lyn基因尝试用基因组分析lyn基因进行beol，揭示了至少两个lyn基因的副本。使用HNRNA作为模具的RT-PCR方法的比较，每个拷贝的cDNA的基础序列和cDNA的碱基序列表明其中一个是功能性的Lyn基因。靶向载体将NEO基因掺入功能性LYN基因外显子3中，并在ES细胞中对帐后通过HOHO缺陷HOHO。所获得的lyn基因缺陷小鼠在发育的发展和发展中并不是特别异常。在脾B细胞中，SIGM交叉连接的桥梁显示出细胞内蛋白的酪氨酸氧化的显着弱化。将来，我们计划使用Lyn缺乏小鼠分析B细胞，凋亡反应等的增殖。