染色体安定性の癌化への関わり(DT40細胞を用いた試み)

染色体稳定性与癌变的关系（尝试使用DT40细胞）

基本信息

批准号：
09253226
负责人：
岩井裕子
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09253226/
关键词：
染色体不安定性相同DNA組換え RAD51 RAD52 RAD54 DT40細胞 DNA2重鎖切断修復

项目摘要

染色体の不安定性に関連する可能性を有する遺伝子 (特に出芽酵母で相同DNA組換え機構に関与することが知られている遺伝子のホモログ)をトリDT40細胞においてノックアウトしその機能を解析し以下の諸点を明らかにした。1.RAD54欠損細胞は放射線照射、メチルメタンスルホン酸(MMS)処理に対して強い感受性を示した。ターゲットインテグレーションの効率も100倍以上低下し、RAD54遺伝子が高等真核細胞の相同DNA組み換え機構に大きく寄与していると共に、高等真核細胞のDNA2重鎖切断の修復が非相同DNA組換え機構だけでなく相同DNA組扱え機構でも修復されていることが判明した。2.RAD52はその変異株が出芽酵母で最も重篤な表現型を示し、また、生化学的に、出芽酵母とヒトと共にRAD51の相同DNA対合反応をRAD52が促進するのが報告されているにも関わらず、RAD52欠損DT40細胞はほとんど放射線照射やMMSに対する感受性を示さず、ターゲット・インテグレーションの効率のみ数倍低下した。3.RAD51欠損細胞は致死となったため、テトラサイクリン誘導プロモーターを用いたコンデイショナルノックアウトを樹立した。テトラサイクリンの添加によりRAD51の発現を抑制すると、ほぼ12時間後に細胞がG2/M期で静止しその後致死となる。致死となる前のカリオタイプの解析により、ほぼ1細胞あたり1つの染色体断裂(イソクロマチド型断裂)が観測され、通常の細胞増殖中のゲノム・インテグリテイーの保持機構に相同DNA組換え機構が重要であることが強く示唆された。

我们敲除禽类 DT40 细胞中可能与染色体不稳定相关的基因（特别是已知参与酿酒酵母同源 DNA 重组机制的基因的同源物），并分析了它们的功能。 1.RAD54缺陷细胞对辐射和甲基甲磺酸（MMS）处理表现出强烈的敏感性。靶标整合效率也下降了100倍以上，表明RAD54基因对高等真核细胞中的同源DNA重组机制有显着贡献，并且高等真核细胞中DNA双链断裂的修复只能由非RAD54基因来完成。 -同源DNA重组机制。事实证明，修复也是通过同源DNA组装处理机制进行的。 2. RAD52突变菌株在酿酒酵母中表现出最严重的表型，并且在生化上，有报道RAD52促进酿酒酵母和人类中RAD51的同源DNA配对反应，然而，RAD52缺陷的DT40细胞对辐射几乎不敏感。或者彩信，只是针对性的整合效率降低了好几倍。 3.由于RAD51缺陷细胞是致命的，我们使用四环素诱导型启动子建立了条件敲除。当添加四环素抑制 RAD51 表达时，细胞在大约 12 小时后在 G2/M 期变得静止，然后死亡。致死前核型分析揭示了每个细胞大约有一个染色体断裂（等染色单体型断裂），这强烈表明同源DNA重组机制对于维持正常细胞增殖期间的基因组完整性非常重要。