相同的組換えでの相同並行三重鎖DNAの働き

同源平行三链DNA在同源重组中的功能

基本信息

批准号：
22K06335
负责人：
柴田武彦
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

相同的組換えがDNA二本鎖切断を正確に修復してゲノムを維持する。相同的組換えの要は、切断端からできる単鎖(ss)DNA域が二重鎖(ds)DNAの中から互いに相同な配列を見つけハイブリッドds (Hyb-ds) を作る反応である。この反応の仕組みは未だに定説がない。単分子クライオ電子顕微鏡解析が示唆する、ある酵素がdsDNAの塩基対を開き、できたss域で相手のssDNAとアニールしてHyb-dsを作る「二重鎖開裂が先」モデルと、従来の生化学研究が支持する、ds構造が開く前にssDNAとの相同配列が見つけ出される「二重鎖開裂が後」モデルとがある。本研究の目的は、「二重鎖開裂が後」モデルにだけ想定される「相同並行三重鎖」の存在を示すことで、このモデルの確証を得る。ウイルスとミトコンドリア以外では、生物種に関わらず、ゲノムDNAの相同DNA組換えでは、RecAまたはそのorthologue (別種生物間で、共通の祖先を持ち同じ機能を担う遺伝子、それがコードする蛋白質）であるRAD51、DMC1がHyb-ds形成を行う。その原型であるRecA (蛋白質) は試験管内で高いHyb-ds形成活性を示すので本研究に最適であるが、形成したHyb-dsをＤループにして加工する機能を併せ持つ。そのため、Hyb-dsができた当初、相同並行三重鎖なのかＤループなのか未だに議論が決着しない。Ｄループ安定化と加工の要はRecAやRAD51, DMC1が単鎖DNAと形成するラセン繊維状構造の内側でＤループに接するL2ループ部位にあることが立体分子構造解析の結果から示唆されている。令和４年度は、L2ループの変異蛋白質の大量精製のシステムを確立し、必要な量の野生型RecAとL2ループ変異蛋白質を調製し、変異RecA (蛋白質) の生化学的な性状を明らかにするため、野生型RecAとの比較解析に着手した。

同源重组准确地修复DNA双链断裂并维持基因组。同源重组的关键是从裂解端形成的单链（SS）DNA区域从双链（DS）DNA中彼此同源的序列，从而产生混合DS（HYB-DS）。仍然没有关于这种反应如何工作的既定理论。一个模型是一个模型，涉及开放dsDNA的基本对并在SS区域退火以创建HYB-DS，并由常规生物化学研究支持的模型，其中与SSDNA同源序列在DS结构之前找到。这项研究的目的是通过显示“同源平行三重链”的存在来确认该模型，这些链仅在“双链裂解后”模型中预期。除病毒和线粒体外，在基因组DNA，RECA或其直系同源的同源DNA重组中（一种编码具有共同祖先基因的基因，以及不同物种之间的功能，IT编码的蛋白质）RAD51和DMC1形成HYB-DS。原型RECA（蛋白质）在测试管中表现出很高的HYB-DS形成活性，使其成为这项研究的理想选择，但它也具有将形成的HYB-DS处理成D-Loop的功能。因此，当首次创建HYB-DS时，辩论仍不清楚是同源的平行三环或D环。立体分子结构分析的结果表明，D-Loop稳定和处理的关键是在L2环位点与与单链DNA形成的螺旋纤维结构内部接触的L2环位点。在2022年，我们建立了一个用于L2环突变蛋白进行质量纯化的系统，准备了所需量的野生型RECA和L2环路突变蛋白，并开始使用野生型RECA进行比较分析，以阐明突变体RECA（蛋白质）的生化特性。