細胞内鉄濃度を制御する転写因子の鉄センシング機構と転写活性化機構

控制细胞内铁浓度的转录因子的铁感应和转录激活机制

基本信息

批准号：
11116217
负责人：
岩井裕子
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

出芽酵母において細胞内鉄濃度を感知すると考えられる転写因子AFT1は鉄の細胞内への取り込み、利用、貯蔵の制御に関与するマスター遺伝子であり、高親和性の鉄の取り込みに必要な遺伝子群のすべての発現がAFT1により制御されている。AFT1は細胞内鉄濃度が低いときにのみその標的遺伝子上流の結合配列に結合することにより、それら遺伝子群の転写制御を行っている。このAFT1による制御の破綻は細胞に過剰の鉄の取り込みを起こしその結果として細胞はG1期で増殖を停止する。AFT1の鉄センシング機構の解明を目指して、その制御モードの解析を行った。培養液の鉄濃度を変化させてC末端にFlag tagを導入し、野生型と同じ表現型を示すAFT1を発現している株を培養し、Northern,Westemを行い、AFT1のmRNAレベルも蛋白量も鉄の存在量に関わらず一定であることを観察した。このことにより、AFT1蛋白の合成、分解が鉄による制御に関わらないことが判明した。核移行など他の制御モードに関しては現在解析中である。また、AFT1の機能ドメインの解析はその制御機構の解明に有用な知見を与えると考えられるため、AFT1の部分欠失変異を作製し、DNA結合ドメインをバンド・シフト法により同定した。その結果、AFT1の中央からN末端側の塩基性アミノ酸が多く存在する領域がAFT1のDNA結合に必要であることが判明した。転写活性化領域、鉄センシングに関わる可能性のある領域など他のドメインについても解析中である。さらに、ババキュロウイルスを用いたAFT1蛋白の大量発現を行い、その精製、鉄との結合能を検討中である。

转录因子AFT1被认为能够感知酿酒酵母细胞内的铁浓度，是参与控制细胞内铁的摄取、利用和储存的主基因，并且是高亲和力铁摄取所需的基因组。表达受 AFT1 调节。仅当细胞内铁浓度较低时，AFT1 通过与其靶基因上游的结合序列结合来调节靶基因的转录。 AFT1 破坏这种调节会导致细胞吸收过量的铁，从而导致细胞在 G1 期停止增殖。为了阐明AFT1的铁传感机制，我们分析了其控制模式。通过改变培养基的铁浓度并在C末端引入Flag标签，我们培养了表达与野生型相同表型的AFT1的菌株，并进行了Northern和Westem的量观察。无论铁的存在量如何，铁都保持恒定。这表明AFT1蛋白的合成和降解不受铁的调节。目前正在分析核转移等其他控制模式。此外，由于对 AFT1 功能域的分析被认为可以为阐明其调控机制提供有用的知识，因此我们创建了 AFT1 的部分缺失突变体，并使用带移位方法鉴定了 DNA 结合域。结果发现，AFT1的中心到N末端的区域富含碱性氨基酸，是AFT1与DNA结合所必需的。其他域，例如转录激活区域和可能涉及铁感应的区域，也正在分析中。此外，我们目前正在使用杆状病毒表达大量AFT1蛋白，并正在研究其纯化和铁结合能力。