細胞内鉄濃度を制御する転写因子の鉄センシング機構と転写活性化機構

控制细胞内铁浓度的转录因子的铁感应和转录激活机制

• 批准号: 11116217
• 负责人: 岩井 裕子
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11116217/
• 关键词: 出芽酵母; 細胞内鉄濃度; 転写因子; 代謝; 鉄取り込み; バンド・シフト法; 鉄センシング機構; 核移行; 出芽酵母; 細胞内鉄濃度; 転写因子; 代謝; 鉄取り込み; バンド・シフト法; 鉄センシング機構; 核移行

出芽酵母において細胞内鉄濃度を感知すると考えられる転写因子AFT1は鉄の細胞内への取り込み、利用、貯蔵の制御に関与するマスター遺伝子であり、高親和性の鉄の取り込みに必要な遺伝子群のすべての発現がAFT1により制御されている。AFT1は細胞内鉄濃度が低いときにのみその標的遺伝子上流の結合配列に結合することにより、それら遺伝子群の転写制御を行っている。このAFT1による制御の破綻は細胞に過剰の鉄の取り込みを起こしその結果として細胞はG1期で増殖を停止する。AFT1の鉄センシング機構の解明を目指して、その制御モードの解析を行った。培養液の鉄濃度を変化させてC末端にFlag tagを導入し、野生型と同じ表現型を示すAFT1を発現している株を培養し、Northern,Westemを行い、AFT1のmRNAレベルも蛋白量も鉄の存在量に関わらず一定であることを観察した。このことにより、AFT1蛋白の合成、分解が鉄による制御に関わらないことが判明した。核移行など他の制御モードに関しては現在解析中である。また、AFT1の機能ドメインの解析はその制御機構の解明に有用な知見を与えると考えられるため、AFT1の部分欠失変異を作製し、DNA結合ドメインをバンド・シフト法により同定した。その結果、AFT1の中央からN末端側の塩基性アミノ酸が多く存在する領域がAFT1のDNA結合に必要であることが判明した。転写活性化領域、鉄センシングに関わる可能性のある領域など他のドメインについても解析中である。さらに、ババキュロウイルスを用いたAFT1蛋白の大量発現を行い、その精製、鉄との結合能を検討中である。

AFT1是一种被认为在萌芽酵母中感知细胞内铁浓度的转录因子，是参与调节铁吸收，利用和储存的主要基因，并且摄取高亲和力铁所需的基因组的所有表达均由Aft1控制。仅当细胞内铁浓度低时，AFT1才与靶基因上游的结合序列结合，从而控制这些基因的转录控制。 AFT1调节的这种破坏会导致细胞吸收过量的铁，从而导致细胞在G1期停止增殖。我们分析了控制模式，以阐明AFT1的铁感应机理。更改了培养基的铁浓度以在C末端引入标志标签，并且对表现出与野生型相同的表型的菌株进行了培养，并进行了北部和WestEM，以观察到Aft1的mRNA水平和蛋白质含量均均保持不变。这表明AFT1蛋白的合成和降解与铁的调节无关。目前正在分析其他控制模式，例如核转运。此外，由于人们认为对AFT1的功能域的分析提供了有用的发现，以阐明其调节机制，因此产生了AFT1的部分缺失突变，并通过频段转移来鉴定DNA结合域。结果，发现从AFT1中心到N末端的许多碱性氨基酸的区域是AFT1的DNA结合所必需的。还正在分析其他领域，例如转录激活区域和可能涉及的铁感应区域。此外，使用Babaculovirus表达了大量的AFT1蛋白，并且正在研究其纯化和结合能力。