修飾オリゴヌクレオチドを用いたT4エンドヌクレアーゼVの基質認識機構の解析

使用修饰寡核苷酸分析 T4 核酸内切酶 V 的底物识别机制

基本信息

批准号：
04254201
负责人：
森岡弘志
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.チミンダイマー部分のリン酸基をホスホロチオエート結合に修飾したオリゴヌクレオチド(dGCACGT[ps]TGCACG、T[ps]T:ホスホロチオエート結合を有するチミンダイマー誘導体)およびその相補鎖(dCGTGCAACGTGC)を化学合成し、T4エンドヌクレアーゼVの基質として用いた。なお、解析にはリン酸結合の2種類のジアステレオ異性体(Rpホスホロチオエート体、Spホスホロチオエート体)をそれぞれ用いた。フィルターバインディングアッセイにより酵素ー基質複合体の解離定数を求めると、通常のチミンダイマーを含む基質を用いた場合には1.6×10^<-8>M、Rpホスホロチオエート体では5.3×10^<-9>M、Spホスホロチオエート体で1.4×10^<-7>Mとなり、両ジアステレオ異性体の間で酵素との結合性に大きな違がみられた。すなわち、Rpホスホロチオエート体の方がSpホスホロチオエート体よりも酵素に対する親和性が高いことがわかった。また、反応速度定数からも同様の結果が得られ、チミンダイマー部分のリン酸残基が酵素と相互作用していることが明らかにされた。2.チミジン2量体に光照射を行うことによって得られた結合ユニットを用いて、チミンダイマーを含むオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を合成した。これらを基質としてメチル化保護実験を行い、T4エンドヌクレアーゼVが特異的に認識しているDNA領域の検索およびその結合様式の解析を試みた。2本鎖DNA中のチミンダイマー部位の相補鎖則アデニン塩基の3位のメチル化が特異的に阻止されたことから、T4エンドヌクレアーゼVが基質DNAのチミンダイマー部位に対してマイナーグルーブ側から結合していることが明らかにされた。

1。寡核苷酸（DGCACGT [PS] TGCACG，T [PS] T：具有磷酸硫酸键的胸腺二聚体衍生物）及其互补链（DCGTGCAACGTGC）化学合成，并用作T4核酸内葡萄酶V.的底物，并用作分析的两种类型，用于分析，并跨度。分别使用了磷酸键的磷酸盐。当使用过滤器结合测定确定酶 - 基质复合物的解离常数，当使用含有正常胸腺胺二聚体的底物时，当使用RP磷酸胸酸RP磷酸胸酯时，量为1.6×10^<-8> m时，使用5.3×10^<-9> m，sps n> 1.4×10^<-7> mM，当在两个映异构体之间观察到酶。也就是说，发现RP磷酸硫酸盐形式对酶的亲和力高于SP磷酸盐剂形式。从反应速率常数中也获得了相同的结果，表明胸腺二聚体部分中的磷酸盐残基与酶相互作用。 2。使用通过辐照胸苷二聚体获得的结合单位，合成了含有胸腺二二聚体及其互补链的寡核苷酸。使用这些作为底物，我们进行了甲基化保护实验，并试图搜索由T4核酸内切酶V特异性识别的DNA区域并分析其结合模式。双链DNA中胸腺二聚体位点的互补链规则被特异性地从腺嘌呤碱基的位置3的甲基化中封闭，这表明T4核酸酶V V与小凹槽的底物DNA的胸腺二聚体位点结合。