紫外線損傷塩基を識別する抗体分子を用いたDNA修復機構の研究

使用识别紫外线损伤碱基的抗体分子研究 DNA 修复机制

基本信息

批准号：
09269201
负责人：
森岡弘志
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

以下に,今年度得られた新たな知見等の成果を示す.(1)シクロブタン型チミンダイマーまたは(6-4)光産物を特異的に認識する1本鎖抗体(TDM2scFv抗体または64M5scFv抗体)を大腸菌システムにより大量調製し,バイオセンサー(BICcore)を用いて,損傷塩基を含む合成オリゴヌクレオチドとの相互作用を速度論的に解析した.両scFv抗体とも,特異的な結合が観察され、結合速度定数kass,解離速度定数kdissならびに解離定数Kdが得られた.TDM2scFvおよび64M5scFv抗体の抗原アナログd8merに対するKd値は,それぞれ7.9±0.1×10^<-11>,1.0±0.1×10^<-10>となった.また,抗原アナログの鎖長を変化させて得られたkassおよびkdiss値から,scFv抗体はFab抗体同様の抗原結合特性を有していることが分かった.また,塩濃度変化の実験から,TDM2scFv抗体の抗原結合には静電相互作用が重要であり,疎水的相互作用が結合を安定化しているという結果が示唆された.このような解析,評価法は抗体分子の改変を進めていく上で有効であることが確認された.(2)TDM2scFv抗体のHCDR3へのランダム変異導入により,天然型TDM2scFv抗体と同程度の抗原結合活性を持つクローンがいくつか得られ,その中にわずかながら天然型scFvより強い活性を持つものがあった.(3)TDM2scFv抗体および64M5scFv抗体にSV40のVP2のNLSを含む42アミノ酸領域を融合させ,真核細胞の核への導入が可能なscFv抗体分子の作製を行っている.VP2のNLS領域の遺伝子合成は完了しており,現在,scFv抗体遺伝子発現ベクターの構築を行っている.

以下是今年获得的新发现的结果。（1）使用E.Coli系统大量制备了特定识别（6-4）光产物的单链抗体（TDM2SCFV抗体或64M5SCFV抗体），并使用含有损坏基础的合成寡核苷酸的相互作用进行了大量抗体（6-4）的相互作用。观察到两种SCFV抗体的特异性结合。获得结合速率常数KAS，解离速率常数KDIS和解离常数KD。 TDM2SCFV和64M5SCFV抗体的抗原模拟D8Mer的KD值分别为7.9±0.1×10^<-11>和1.0±0.1×10^<-10>。此外，通过更改抗原类似物的链长而获得的KASS和KDIS值表明SCFV抗体具有与Fab抗体相同的抗原结合特性。此外，对不断变化的盐浓度的实验表明，静电相互作用对于TDM2SCFV抗体的抗原结合至关重要，疏水相互作用稳定结合。这种分析和评估方法被证实在改变抗体分子的进展中有效。（2）TDM2SCFV抗体中HCDR3的随机突变具有与天然TDM2SCFV抗体相同的抗原结合活性。获得了几个克隆，其中一些具有比天然SCFV稍强的活性。（3）将TDM2SCFV抗体和64M5SCFV抗体融合到SV40中含有VP2的NLS的42个氨基酸区域，并创建了可以引入真实神经细胞核中的SCFV抗体分子。 VP2的NLS区域的基因合成已经完成，目前正在构建SCFV抗体基因表达载体。