ヒト増殖細胞核抗原の構造と機能の解析

人增殖细胞核抗原结构与功能分析

基本信息

批准号：
06772121
负责人：
森岡弘志
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト増殖細胞核抗原(PCNA)の構造-機能相関の解明を目的として、蛋白質工学的手法により作製したヒトPCNA変換体とRF-C(複製因子C)およびDNAポリメラーゼδとの相互作用を調べた。以下に、本研究によって得られた新たな知見等の成果を示す。1.T7RNAポリメラーゼ系を用いたヒトPCNA発現用プラスミドを構築し、大腸菌内でヒトPCNAを大量発現させた。各種カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、培養液1L当たり約30mgのPCNA蛋白質を得ることができた。2.PCR法を応用した部位特異的変異法により、ヒトPCNA遺伝子に変異を導入した。標的部位は生物間で高いホモロジーを示す29種の酸性または塩基性アミノ酸とし、これらをすべてアラニンに変換した。上記と同様の方法で、これらPCNA変換体を得た。3.RF-CおよびDNAポリメラーゼδとの相互作用を調べたところ、以下のことが示された。(1)C末端のLys254〜Glu259からなる領域はRF-CのATPase活性を促進するのに重要であった。(2)いくつかの酸性または塩基性アミノ酸はDNAポリメラーゼδのDNA合成活性の促進やRF-CのATPase活性の促進に関与していた。このうち9個所の塩基性アミノ酸残基(Lys13、Lys14、Lys20、Lys77、Lys80、Arg146、Arg149、Arg210、Lys217)は、予想されたリング状構造の内側のα-ヘリックス領域にほぼ一致しており、DNAと相互作用すると推定された。しかしながら、上記の活性が完全に失われたPCNA変換体を得ることはできなかった。すなわち、PCNAの複数のアミノ酸残基がDNAポリメラーゼδ、RF-CあるいはDNAと協同的に相互作用している可能性が考えられた。

为了阐明人增殖细胞核抗原（PCNA）的结构与功能关系，我们研究了通过蛋白质工程方法制备的人PCNA转化子、RF-C（复制因子C）和DNA聚合酶δ之间的相互作用。这项研究的结果，包括新的发现，如下所示。 1.我们利用T7 RNA聚合酶系统构建了表达人PCNA的质粒，并在大肠杆菌中大量表达了人PCNA。采用各种柱层析方法纯化，每升培养液可得到约30mg的PCNA蛋白。 2.使用PCR通过定点诱变将突变引入人PCNA基因。目标位点是生物体之间表现出高度同源性的29种酸性或碱性氨基酸，所有这些都被转化为丙氨酸。这些PCNA转换器以与上述相同的方式获得。 3.对RF-C和DNA聚合酶δ之间相互作用的检查揭示了以下内容。 (1)由Lys254-Glu259组成的C端区域对于促进RF-C的ATPase活性很重要。 (2)一些酸性或碱性氨基酸参与促进DNA聚合酶δ的DNA合成活性和RF-C的ATP酶活性。其中 9 个碱性氨基酸残基（Lys13、Lys14、Lys20、Lys77、Lys80、Arg146、Arg149、Arg210、Lys217）几乎与预测的环形结构的内部 α 螺旋区域匹配，推测与 DNA 相互作用。然而，不可能获得完全丧失上述活性的PCNA转换器。换句话说，认为PCNA的多个氨基酸残基可能与DNA聚合酶δ、RF-C或DNA协同相互作用。