修飾オリゴヌクレオチドを用いた紫外線損傷DNA修復機構の解析

使用修饰寡核苷酸分析紫外线损伤的 DNA 修复机制

基本信息

批准号：
06263201
负责人：
森岡弘志
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

以下に、今年度得られた新たな知見等の成果を示す。(1)チミンダイマーのヌクレオシド間のリン酸残基をメチルホスホネートに修飾したオリゴヌクレオチド(d(GCACGT[pMe]TGCACG、T[pMe]T:メチルホスホネート結合を有するチミンダイマー誘導体)を化学合成し、高速液体クロマトグラフィーで分離精製した。なお、合成の際に生じるチミンダイマー間のリン酸結合の2種類のジアステレオマ-(Rpメチルホスホネート体およびSpメチルホスホネート体)をそれぞれ分離同定した。相補鎖とハイブリダイズさせて2本鎖とした後、合成遺伝子を大腸菌内で発現させ精製されたT4エンドヌクレアーゼVを用いて、フィルターバインディング法により酵素-基質複合体の解離定数を求めた。その結果、通常のチミンダイマーを含む基質を用いた場合には2.0×10^<-8>M、Spメチルホスホネート体では1.6×10^<-7>M、Rpメチルホスホネート体では結合がみられなかった。また、酵素による基質の切断反応を調べたところ、Spメチルホスホネート体では切断が見られたのに対して、Rpメチルホスホネート体では切断はみられなかった。すなわち、(i)チミンダイマー部分のリン酸基に存在する酵素原子が酵素と相互作用していること、(ii)T4エンドヌクレアーゼVは基質DNA中のチミンダイマー部位に対してマイナ-グルーブ側から結合していることが明らかにされた。この解析結果は、既に得られているメチル化保護法の結果と一致した。(2)(6-4)光産物を含むオリゴヌクレオチド(d(CAAT[6-4]TAAG)、T[6-4]T:(6-4)光産物)を合成した。さらに、T4DNAリガーゼにより結合させ、鎖長28および57の2本鎖DNAを作製した。また、チミンダイマー、(6-4)光産物等のDNA損傷を特異的に認識する数種のモノクローナル抗体の可変領域部のcDNAをクローニングした。

以下显示了今年获得的新知识的结果。 (1) Chemin Dimmer's chimin dimmer's nucleoside lin acid residue is modified to methylphosphone (D (D (GCACGT] TGCACG, T [PME] T [PME] T: Timin Dimmer derivative with methylphone) bond) Separated and refilled with a high-speed液体数学，两种类型的Lin-stereo键（RP甲基手机体）和两链链后的杂种。 - 底层剖腹产时，使用含有奇物剂的底物，2.0×10^<-8> m，SP甲基手机体1.6×10^-7> m，在RP甲基手机中无结合。 SP甲基手机的身体是断开的，但RP甲基手机体并未断开连接分析结果与甲基化保护定律（2）（6-4）寡核苷酸（D（6-4）taag），T [6-4）T：（6-4）结合在一起。两种链的DNA和（6-4）。