修飾オリゴヌクレオチドを用いた紫外線損傷DNA修復機構の解析

使用修饰寡核苷酸分析紫外线损伤的 DNA 修复机制

基本信息

批准号：
06263201
负责人：
森岡弘志
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

以下に、今年度得られた新たな知見等の成果を示す。(1)チミンダイマーのヌクレオシド間のリン酸残基をメチルホスホネートに修飾したオリゴヌクレオチド(d(GCACGT[pMe]TGCACG、T[pMe]T:メチルホスホネート結合を有するチミンダイマー誘導体)を化学合成し、高速液体クロマトグラフィーで分離精製した。なお、合成の際に生じるチミンダイマー間のリン酸結合の2種類のジアステレオマ-(Rpメチルホスホネート体およびSpメチルホスホネート体)をそれぞれ分離同定した。相補鎖とハイブリダイズさせて2本鎖とした後、合成遺伝子を大腸菌内で発現させ精製されたT4エンドヌクレアーゼVを用いて、フィルターバインディング法により酵素-基質複合体の解離定数を求めた。その結果、通常のチミンダイマーを含む基質を用いた場合には2.0×10^<-8>M、Spメチルホスホネート体では1.6×10^<-7>M、Rpメチルホスホネート体では結合がみられなかった。また、酵素による基質の切断反応を調べたところ、Spメチルホスホネート体では切断が見られたのに対して、Rpメチルホスホネート体では切断はみられなかった。すなわち、(i)チミンダイマー部分のリン酸基に存在する酵素原子が酵素と相互作用していること、(ii)T4エンドヌクレアーゼVは基質DNA中のチミンダイマー部位に対してマイナ-グルーブ側から結合していることが明らかにされた。この解析結果は、既に得られているメチル化保護法の結果と一致した。(2)(6-4)光産物を含むオリゴヌクレオチド(d(CAAT[6-4]TAAG)、T[6-4]T:(6-4)光産物)を合成した。さらに、T4DNAリガーゼにより結合させ、鎖長28および57の2本鎖DNAを作製した。また、チミンダイマー、(6-4)光産物等のDNA損傷を特異的に認識する数種のモノクローナル抗体の可変領域部のcDNAをクローニングした。

以下是今年获得的新发现和其他结果的结果。（1）寡核苷酸（D（GCACGT [PME] TGCACG，T [PME] T：具有甲基膦酸甲酯键的胸腺二聚体衍生物化学合成，并通过高性能液体色谱纯化并纯化了两种类型在合成过程中。与互补链杂交以形成双链后，在大肠杆菌中表达合成基因，并使用纯化的T4核酸内切酶V来确定酶 - 基底复合物通过滤波器结合的离解常数。结果，当使用含有正常胸腺胺二聚体的底物时，使用2.0×10^<-8> m时观察到结合，对于SP甲基膦酸盐形式，观察到1.6×10^<-7> m，并且对于RP甲基膦酸盐形式，未观察到结合。此外，在检查与酶的底物裂解反应时，在SP甲基膦酸酯形式中观察到裂解，而在RP甲基膦酸盐形成中未观察到裂解。换句话说，据透露，（i）胸腺二聚体部分磷酸盐组中存在的酶与酶相互作用，并且（ii）T4核酸酶V与次要凹槽中的胸骨二聚体位点结合。该分析结果已经是在（2）含有（6-4）光产物（D（Caat [6-4] Taag），T [6-4] T：（6-4）光propoducts）的（D（6-4）t [6-4] T [6-4）的寡核苷酸中获得的甲基化保护方法的结果。此外，通过与T4 DNA连接酶结合制备了链长为28和57的双链DNA。此外，将几种单克隆抗体的可变区域中的cDNA克隆了，这些cDNA特异性地识别了DNA损伤，例如胸腺二聚体和（6-4）光产物。