ヒト増殖細胞核抗原(PCNA)変換体を用いるDNA修復機構の解析

使用人增殖细胞核抗原 (PCNA) 转化体分析 DNA 修复机制

• 批准号: 08772077
• 负责人: 森岡 弘志
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08772077/
• 关键词: 増殖細胞核抗原; PCNA; DNA修復; 無細胞ヌクレオチド修復系

本研究の代表者は,PCNAが関与するDNA修復の分子機構の解明を目的として,無細胞ヌクレオチド除去修復系によるin vitroでのDNA損傷修復反応を各種ヒトPCNA変換体を用いて行うことにより,(1)PCNAがDNA損傷の除去修復因子と相互作用する部位の解析,ならびに(2)PCNAと相互作用するDNA修復因子を探索するための実験系の構築を試みた.以下に,今年度得られた新たな知見等の成果を示す.1.Richard D.Woodらにより報告されている方法に従って,HeLa3S細胞の核抽出液をphosphocelluloseカラムクロマトグラフィー,続いてDEAE-Biogelカラムクロマトグラフィーにより分画し,細胞由来のPCNAおよび1本鎖DNA結合蛋白質(HSSB)を含まないフラクション(CFII)とHSSBのみを含むフラクション(CFIA)を調製した.2.紫外線照射により損傷を受けたプラスミドDNAを鋳型として,上記CFIIおよびCFIAフラクションに,既に大腸菌のシステムにより発現,精製された組換え型PCNAを加えて,in vitroでのDNA損傷の修復反応を行った.3.シクロブタン型チミンダイマーあるいは(6-4)光産物を含む合成オリゴヌクレオチドと適当な配列および鎖長のオリゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼを用いて結合させ,紫外線損傷塩基をその中央部に1ケ所だけ有する67b.p.の2本鎖DNAフラグメントを作製した.現在,2.の実験において,損傷DNA修復活性の向上を目指して,条件検討を繰り返し行っている.

这项研究的代表试图阐明涉及PCNA的DNA修复的分子机制，使用各种人PCNA转换器，使用无细胞核苷酸切除修复系统在体外进行DNA损伤修复反应，并分析（1）分析PCNA与DNA损伤修复因子相互作用的PCNA与PCNA相互作用的PCNA相互作用的部位。以下显示了今年获得的新发现的结果1。通过磷酸纤维素柱色谱分离HELA3S细胞的Richard核提取物，然后是Deae-Biogel色谱柱色谱法，以制备馏分（CFII）和HSSB，而HSSB仅使用不含细胞衍生的PCNA和单链DNA结合蛋白（HSSB）（HSSB）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）（CFI）紫外线照射为模板，并将上述CFII和CFIA分数添加到上述CFII和CFIA级分中，这些分数已经由大肠杆菌系统表达和纯化，然后将纯化的重组PCNA添加到大肠杆菌系统中。在体外进行了DNA损伤的修复反应。 3。将含有环丁烷型胸腺胺二聚体或（6-4）光药物的合成寡核苷酸与使用T4 DNA连接酶的适当序列和长度的寡核苷酸和67B.P.合并。准备了双链的DNA片段，仅准备了中心的一个紫外线损害的底座。目前，在实验2中反复检查条件。目的是改善受损DNA的修复活性。