ヒト増殖細胞核抗原(PCNA)変換体を用いるDNA修復機構の解析

使用人增殖细胞核抗原 (PCNA) 转化体分析 DNA 修复机制

• 批准号: 08772077
• 负责人: 森岡 弘志
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08772077/
• 关键词: 増殖細胞核抗原; PCNA; DNA修復; 無細胞ヌクレオチド修復系

本研究の代表者は,PCNAが関与するDNA修復の分子機構の解明を目的として,無細胞ヌクレオチド除去修復系によるin vitroでのDNA損傷修復反応を各種ヒトPCNA変換体を用いて行うことにより,(1)PCNAがDNA損傷の除去修復因子と相互作用する部位の解析,ならびに(2)PCNAと相互作用するDNA修復因子を探索するための実験系の構築を試みた.以下に,今年度得られた新たな知見等の成果を示す.1.Richard D.Woodらにより報告されている方法に従って,HeLa3S細胞の核抽出液をphosphocelluloseカラムクロマトグラフィー,続いてDEAE-Biogelカラムクロマトグラフィーにより分画し,細胞由来のPCNAおよび1本鎖DNA結合蛋白質(HSSB)を含まないフラクション(CFII)とHSSBのみを含むフラクション(CFIA)を調製した.2.紫外線照射により損傷を受けたプラスミドDNAを鋳型として,上記CFIIおよびCFIAフラクションに,既に大腸菌のシステムにより発現,精製された組換え型PCNAを加えて,in vitroでのDNA損傷の修復反応を行った.3.シクロブタン型チミンダイマーあるいは(6-4)光産物を含む合成オリゴヌクレオチドと適当な配列および鎖長のオリゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼを用いて結合させ,紫外線損傷塩基をその中央部に1ケ所だけ有する67b.p.の2本鎖DNAフラグメントを作製した.現在,2.の実験において,損傷DNA修復活性の向上を目指して,条件検討を繰り返し行っている.

这项研究的代表在体外的DNA损伤恢复反应中使用了无细胞 - 无细胞的工具，目的是阐明PCNA所涉及的DNA恢复的分子机制。与DNA损伤修复因子相互作用的部分，（2）（2）我试图建立一个实验系统来探索与PCNA相互作用的DNA修复因子。木材和其他，将HELA3S细胞的核提取物分为磷酸柱色谱法，然后除以deae -biogel柱沿形，细胞衍生的PCNA和单链DNA结合蛋白（HSSB），馏分（CFII）（CFII）和分数（ CFIA仅包含HSSB（CFIA）。2通过添加和精制的重组PCNA与Escherichia coli System添加和精制的重组PCNA，CFII和CFIA分数已被重新张开。使用T4DNA连接酶合并链长度寡核苷酸，并且在中心中仅创建一个紫外线损伤基础。