エンドペプチダーゼ組み合わせ法によるレセプターラベル部位の決定

内肽酶组合法测定受体标记位点

• 批准号: 08877336
• 负责人: 橋本 祐一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877336/
• 关键词: エンドペプチダーゼ; アフィニティラベル; レチノイン酸レセプター; プロテアーゼ; レセプター; プローブ; ケイ光標識; ペプチド; 光親和性ラベル; アフィニティーゲル; レチノイド; レチノイン酸受容体; 質量分析; 結合部位; フタルイミド; 分子認識

本年度は、提唱するエンドペプチダーゼ組み合わせ法によるレセプターラベル部位の決定法を、方法論として確立すべく、ここのステップの施行条件の最適化を図るとともに、同方法の応用・適応範囲の拡充並びにそれによる新規知見の獲得を目指した。方法論としての確立のためには、核内レチノイン酸レセプターを素材とした研究を展開した。その結果、(1) 提唱する方法に用いるラベル化剤及びその有効性を事前に検討するためのブローブの一般設計法並びに一般調製法を確立した。(2) 提唱する方法に用いるエンドプロテアーゼの一般使用法、一般反応条件などを確立すると共に、酵素反応物の一般取扱法、一般分析法を確立した。(3) 提唱する方法により一層の信頼性を付与すべく、同方法にエレクトロスプレー質量分析によるエンドプロテアーゼ消化物の分析法を導入することを検討し、これらの方法が相乗的に得られる結果の信頼性を高めることを確認し、両方法の一般的融合利用法を大旨確立した。確立した方法の応用としては、a)TNF-αの生産調節にかかわる薬物受容体の検出、b)アミノペプチダーゼN阻害剤の新たな分子標的の検出、に成果があった。すなわち、(4) TNF-αの生産促進並びに生産抑制にかかわる薬物受容体各々の検出に成功した。(5) 小分子非ペプチド型アミノペプチダーゼN(APN)阻害剤の分子標的として、APN活性を有しながらこれまでAPNとして確認されている酵素とは異なるものを発見した。

今年，为了建立所提出的用于确定受体标记位点的内肽酶组合方法作为一种方法学，我们将优化该步骤的执行条件，扩大该方法的应用范围和适应范围，并创建新的目的是获得知识。为了建立这种方法，我们使用核视黄酸受体作为材料进行了研究。结果，（1）我们建立了该方法中使用的标记剂的通用设计方法和通用制备方法，以及预检验其有效性的探针； (2)建立了该方法中所用内切蛋白酶的一般使用方法和一般反应条件，以及酶反应物的一般处理方法和一般分析方法。 (3)为了进一步增加所提出方法的可靠性，我们将考虑在所提出的方法中引入一种通过电喷雾质谱分析内切蛋白酶消化物的方法，并将研究通过这些方法获得的协同结果的可靠性。进行了改进，并确立了两种方法相结合的总体目的。已建立方法的应用导致a) 检测参与TNF-α 产生调节的药物受体，b) 检测氨肽酶N 抑制剂的新分子靶点。即，(4)我们成功地检测到了参与促进和抑制TNF-α产生的每种药物受体。 （5）作为小分子非肽氨肽酶N（APN）抑制剂的分子靶点，我们发现了一种具有APN活性但与之前鉴定为APN的酶不同的酶。

项目成果

A.Azuma ら: "Photoaffinity labeling of tumor promoter-binding protein 〜" Biol.Pharm.Bull.20・1. 6-9 (1997)

A.Azuma 等：“肿瘤启动子结合蛋白的光亲和标记〜”Biol.Pharm.Bull.20·1（1997）。

T.Sasaki, Y.Hashimoto: "Photoaffinity labeling of RARs and mapping of labeled sites by〜" Methods in Mol.Biol.(印刷中). 298-305 (1998)

T.Sasaki，Y.Hashimoto：“RAR 的光亲和标记和标记位点的映射〜”《Mol.Biol. 方法》（出版中）298-305（1998 年）。

T.Tashima ら: "Polyenylidene thiazolidine derivatives with retinoidal activities." Chem.Pharm.Bull.45・11. 1805-1813 (1997)

T. Tashima 等人：“具有类视黄醇活性的聚亚乙烯基噻唑烷衍生物。”Chem.Pharm.Bull.45·11 1805-1813 (1997)。

Aya Tanatani 他7名: "Novel DNA minor groove binders with an aromatic layered〜" Nucleic Acids Symposium Series. 39. 31-32 (1998)

Aya Tanatani 和其他 7 人：“具有芳香分层的新型 DNA 小沟结合物 ~”核酸研讨会系列 39. 31-32 (1998)。

Yuichi Hashimotoら: "Photo affinity labeling of RAR and mapping the labeled sites with endoproteinase〜" Methods in Molecular Biology. (印刷中).

Yuichi Hashimoto 等人：“RAR 的光亲和标记并用内切蛋白酶绘制标记位点~”分子生物学方法（正在出版）。