生細胞上の内在性受容体膜蛋白質への選択的合成プローブ導入技術の開発と応用

活细胞内源性受体膜蛋白选择性合成探针导入技术的开发及应用

基本信息

批准号：
22850006
负责人：
築地真也
金额：
$ 2万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

現代の蛋白質科学では、生きた細胞や生体複雑系における蛋白質の機能・動態・相互作用をin situで解析することが大きな課題となっている。このような研究において不可欠となるのが「蛋白質の選択的標識技術」である。現在、蛍光蛋白質を対象蛋白質に融合して用いるアプローチが主流となっているが、この手法では、あくまでも細胞内に人工的に発現させた改変型蛋白質を観察しており、細胞内にもともと存在する真の対象蛋白質を見ているわけではない。細胞内在性の蛋白質のin situ機能解析に使用可能な蛋白質標識法は、今なお確立されていない。本研究では、研究代表者が最近開発した「リガンド指向型トシル(LDT)化学」をもとに、この未開拓領域に挑戦する。LDT化学は、細胞内に内在する標的蛋白質を選択的かっ部位特異的に、そして機能を損なうことなく化学修飾することのできる現在唯一の手法である。本研究では、GPCRのブラジキニンB2受容体(B2R)とGPIアンカー型蛋白質の葉酸受容体(FR)を標的蛋白質として定め、生細胞上のこれらの内在性受容体膜蛋白質の蛍光修飾およびその局在動態のリアルタイムイメージングに取り組む。本年度はまず、両蛋白質に対する選択的LDTラベル化剤の合成から着手した。B2Rに対してはアンタゴニストペプチドを、FRに対しては葉酸をリガンドとし、これらとビオチンプローブをトシル基(フェニルスルホン酸エステル)によって連結したラベル化剤を合成した。更に、得られたラベル化剤を用い、PC12およびKB細胞上の内在性B2RおよびFRのラベル化を検討した。これまでに、B2Rのラベル化は上手くいっていないが、FRについては低収率ながらもラベル化が進行していることが確認された。今後、ラベル化剤の分子構造(特にスペーサー長)の最適化を行い、蛍光修飾とイメージング実験へと進む予定である。

现代蛋白质科学的一个主要挑战是活细胞和复杂生物系统中蛋白质功能、动力学和相互作用的原位分析。此类研究不可或缺的是“选择性蛋白质标记技术”。目前主流的方法是使用与目标蛋白融合的荧光蛋白，但这种方法只观察到细胞内人工表达的修饰蛋白，而不是细胞内原本存在的蛋白。到达真正的目标蛋白。目前尚未建立可用于细胞蛋白原位功能分析的蛋白标记方法。在这项研究中，我们将基于首席研究员最近开发的“配体定向甲苯磺酰基（LDT）化学”来研究这个未开发的领域。 LDT化学是目前唯一能够选择性地、定点地化学修饰细胞内靶蛋白而不损害其功能的方法。在这项研究中，我们确定了GPCR缓激肽B2受体（B2R）和GPI锚定蛋白叶酸受体（FR）作为靶蛋白，并研究了这些内源性受体膜蛋白在活细胞上的荧光修饰和定位。动力学的时间成像。今年，我们开始合成这两种蛋白质的选择性 LDT 标记剂。合成了以拮抗肽为B2R的配体、以叶酸为FR的配体的标记剂，通过甲苯磺酰基（苯磺酸酯）与生物素探针连接。此外，使用所得标记剂，研究了PC12和KB细胞上的内源性B2R和FR的标记。到目前为止，B2R的标记尚未成功，但已证实FR的标记正在取得进展，尽管产量较低。未来，我们计划优化标记剂的分子结构（特别是间隔基长度）并进行荧光修饰和成像实验。