合成化合物による選択的スプライシングの制御

用合成化合物控制选择性剪接

基本信息

批准号：
02F00501
负责人：
萩原正敏
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00501/
关键词：
SRPK Clk hPRP4 阻害剤特異的結合蛋白

项目摘要

pre-mRNAの選択的スプライシングは,多細胞生物がその多様性を生み出すために獲得した遺伝子発現制御プロセスであると考えられる.実際FTDP17など幾つかの神経変性疾患は選択的スプライシングの異常に起因することが判明しつつあり,選択的スプライシング制御機構は新しいドラッグターゲットとなりうる.SF2/ASFなどのSRタンパクはそのリン酸化状態により,スプライスゾームの形成と選択的スプライシングに重要な役割を果たしていると考えられているので、そのリン酸化酵素(SRPK1&2,Clk1〜4,hPRP4など)の阻害剤や活性化剤を創成できれば、基礎科学のみならず、臨床医学にも多大な貢献を期待できる。Hela細胞抽出液をゲルろ過クロマトグラフィーにより分画すると、hPRP4活性は300kDa以上の高分子フラクションに見出され、hPRP4はHela細胞中で複合体を形成していることが示唆された。hPRP4がいかなる基質蛋白や調節蛋白と複合体を形成するのかを解明するため、hPRP4cDNAをタンデムタグ付き発現ベクターに組み込み、293細胞に導入した。薬剤マーカーにより、hPRP4発現細胞株を樹立し、タンデムタグを利用して、hPRP4複合体を精製した。精製フラクションに、CBB染色で染まる数本のバンドを認め、hPRP4の特異的結合蛋白が精製できた。質量分析などにより、これらhPRP4結合蛋白の一つはSRPK1であることが判明した。ところが組替え蛋白を用いた共沈殿実験より、hPRP4とSRPK1は直接結合するわけではないことが判明し、hPRP4は複数の結合蛋白は巨大な複合体を形成していることが判明した。今後、さらにhPRP4結合蛋白の同定を進め、hPRP4の基質蛋白や調節蛋白を同定し、そのリン酸化の生理的意義を解明する予定である。

前mRNA的选择性剪接被认为是多细胞生物获得的基因表达控制过程，以产生其多样性。事实上，一些神经退行性疾病如FTDP17是由选择性剪接异常引起的，人们越来越清楚选择性剪接控制。机制可能作为新的药物靶点。 SR 蛋白（例如 2/ASF）被认为在剪接体的形成和选择性剪接中发挥着重要作用，具体取决于它们的磷酸化状态，如果我们能够为此创建抑制剂或激活剂，那么我们不仅可以对基础蛋白做出重大贡献。科学也涉及临床医学。当通过凝胶过滤色谱法对 HeLa 细胞提取物进行分级时，在 300 kDa 或更高的高分子量级分中发现了 hPRP4 活性，表明 hPRP4 在 HeLa 细胞中形成了复合物。为了阐明hPRP4与哪些底物蛋白和调节蛋白形成复合物，将hPRP4 cDNA插入串联标记的表达载体中并引入293细胞中。我们使用药物标记物建立了表达 hPRP4 的细胞系，并使用串联标签纯化了 hPRP4 复合物。纯化组分中观察到多条CBB染色条带，表明可以纯化hPRP4的特异性结合蛋白。质谱分析显示这些 hPRP4 结合蛋白之一是 SRPK1。然而，使用重组蛋白的共沉淀实验表明，hPRP4 和 SRPK1 并不直接结合，并且 hPRP4 形成了多个结合蛋白的大型复合物。未来，我们计划进一步鉴定hPRP4结合蛋白，鉴定hPRP4底物蛋白和调节蛋白，并阐明其磷酸化的生理意义。