合成化合物による選択的スプライシングの制御

用合成化合物控制选择性剪接

基本信息

批准号：
02F00501
负责人：
萩原正敏
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00501/
关键词：
SRPK Clk hPRP4 阻害剤特異的結合蛋白

项目摘要

pre-mRNAの選択的スプライシングは,多細胞生物がその多様性を生み出すために獲得した遺伝子発現制御プロセスであると考えられる.実際FTDP17など幾つかの神経変性疾患は選択的スプライシングの異常に起因することが判明しつつあり,選択的スプライシング制御機構は新しいドラッグターゲットとなりうる.SF2/ASFなどのSRタンパクはそのリン酸化状態により,スプライスゾームの形成と選択的スプライシングに重要な役割を果たしていると考えられているので、そのリン酸化酵素(SRPK1&2,Clk1〜4,hPRP4など)の阻害剤や活性化剤を創成できれば、基礎科学のみならず、臨床医学にも多大な貢献を期待できる。Hela細胞抽出液をゲルろ過クロマトグラフィーにより分画すると、hPRP4活性は300kDa以上の高分子フラクションに見出され、hPRP4はHela細胞中で複合体を形成していることが示唆された。hPRP4がいかなる基質蛋白や調節蛋白と複合体を形成するのかを解明するため、hPRP4cDNAをタンデムタグ付き発現ベクターに組み込み、293細胞に導入した。薬剤マーカーにより、hPRP4発現細胞株を樹立し、タンデムタグを利用して、hPRP4複合体を精製した。精製フラクションに、CBB染色で染まる数本のバンドを認め、hPRP4の特異的結合蛋白が精製できた。質量分析などにより、これらhPRP4結合蛋白の一つはSRPK1であることが判明した。ところが組替え蛋白を用いた共沈殿実験より、hPRP4とSRPK1は直接結合するわけではないことが判明し、hPRP4は複数の結合蛋白は巨大な複合体を形成していることが判明した。今後、さらにhPRP4結合蛋白の同定を進め、hPRP4の基質蛋白や調節蛋白を同定し、そのリン酸化の生理的意義を解明する予定である。

据信，前mRNA的替代剪接是多细胞生物获得多样性的基因表达控制过程。实际上，发现几种神经退行性疾病（例如FTDP17）是由于替代剪接中的异常，替代剪接控制机制可能成为新药物靶标。因为SR蛋白（例如SF2/ASF）被认为在剪接鞋底的形成和替代剪接状态中起着重要作用，如果它们可以创建其磷酸化酶的抑制剂和激活剂（SRPK1＆2＆2，CLK1-4，HPRP4，HPRP4等），那么他们也可以做出贡献，而不是造成临床的贡献。通过凝胶过滤色谱法分馏HeLa细胞提取物在300 kDa以上的聚合物馏分中显示HPRP4活性，这表明HPRP4在HELA细胞中形成复合物。为了澄清哪种底物和调节蛋白HPRP4与HPRP4 cDNA形成复合物，将HPRP4 cDNA掺入了串联标记的表达载体中，并引入了293个细胞中。用药物标记建立了表达细胞系的HPRP4，并使用串联标签纯化HPRP4复合物。在纯化的部分中观察到了几个被CBB染色的条带，并纯化了HPRP4的特异性结合蛋白。质谱法表明，这些HPRP4结合蛋白之一是SRPK1。但是，使用重组蛋白的共沉淀实验表明HPRP4和SRPK1不直接结合，并且HPRP4的结合蛋白形成了巨大的复合物。将来，我们计划进一步鉴定HPRP4结合蛋白，鉴定HPRP4的底物蛋白和调节蛋白，并阐明其磷酸化的生理意义。