選択的スプライシングのリン酸化制御機構

选择性剪接的磷酸化控制机制

基本信息

批准号：
11155208
负责人：
萩原正敏
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11155208/
关键词：
SRPK SF2 ASF splicing

项目摘要

我々はSRPK1と分裂酵母の細胞周期制御遺伝子Dsk1の高い相同性に着目して、マウス脳mRNAより新規のSR蛋白リン酸化酵素をクローニングし、SRPK2と名付けた。大腸菌で発現させたSRPK1とSRPK2を用いて、GST-SF2Pull-Down Kinase Assayを行ったところ、SF2/ASFに結合してリン酸化活性を示した。実際に細胞内でもSF2/ASFとSRPKが複合体を形成しているかどうか調べるためCOS7細胞にSF2/ASFとSRPKを共発現させ、共沈実験およびkinase-assayを行ったところ、SF2/ASFとSRPKは細胞内においても結合していることが確認できた。またSF2/ASFのdeletion mutantを用いた解析により、このSF2/SRPK複合体の形成にはRSドメインが必須で、その結合部位はSRPKによるリン酸化部位と一致することが確認できた。さらにSF2/ASFのリン酸化状態により結合能に差がみられるかを調べたところ、リン酸化されていないSF2/ASFとSRPKは複合体を形成するが、リン酸化されたSF2/ASFとSRPKはもはや結合しなかった。リン酸化活性化能をもたないSRPK2^<K108R>をHeLa細胞内で発現させたところ、核内でspeckled patternを示していたSF2/ASFは核外に移行した。この結果よりSF2/ASFの細胞内局在は、SRPKによって制御されている可能性があると考えられる。

针对SRPK1与裂殖酵母细胞周期控制基因Dsk1的高度同源性，我们从小鼠脑mRNA中克隆了一种新型SR蛋白激酶，并将其命名为SRPK2。当使用大肠杆菌中表达的 SRPK1 和 SRPK2 进行 GST-SF2Pull-Down 激酶测定时，它们与 SF2/ASF 结合并表现出磷酸化活性。为了研究SF2/ASF和SRPK是否确实在细胞内形成复合物，我们在COS7细胞中共表达SF2/ASF和SRPK，并进行共沉淀实验和激酶测定，证实SRPK也在细胞内结合。此外，使用SF2/ASF缺失突变体的分析证实RS结构域对于SF2/SRPK复合物的形成至关重要，并且其结合位点与SRPK的磷酸化位点一致。此外，我们研究了是否根据SF2/ASF的磷酸化状态观察到结合能力的差异，并发现未磷酸化的SF2/ASF和SRPK形成复合物，但磷酸化的SF2/ASF和SRPK不再形成复合物。当不具有激活磷酸化能力的SRPK2^<K108R>在HeLa细胞中表达时，在细胞核内具有斑点图案的SF2/ASF被转移至细胞核外。该结果表明SF2/ASF的细胞内定位可能受SRPK控制。