細胞内アンチセンスDNA発現ベクターの開発とがんの遺伝子治療への応用

细胞内反义DNA表达载体的开发及其在癌症基因治疗中的应用

• 批准号: 13218086
• 负责人: 島本 整
• 金额: $ 2.94万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13218086/
• 关键词: アンチセンスDNA; 逆転写酵素; レトロン; 大腸菌; msDNA; DNA enzvme

細胞内でアンチセンスDNAなどの任意の一本鎖DNAを合成するためには,細菌逆転写酵素を利用するmsDNA(Multicopy single-stranded DNA)合成系が現在唯一の方法であると考えられている。これまでの研究において細菌内でアンチセンスDNAを合成するベクターを開発し,特定の遺伝子の発現抑制に成功している。また,広義のアンチセンス法の一種であるリボザイム(ribozyme)は,RNA切断活性を持つRNAであり,標的mRNAを切断することによって特定の遺伝子の発現を抑制するため現在までにいくつかの細胞内合成応用例が報告されている。しかし,リボザイムの切断認識配列がある程度限定されているため,目的とするRNAによっては切断することができない場合もある。一方,DNA enzymeは,RNA切断活性を持つDNAであり,切断部位の認識配列にリボザイムほどの制限がない。そのため広範囲に応用可能であることが期待されているが,現在までに細胞内合成系は確立されていない。本研究では,同じベクターを用いて細菌内でDNA enzymeの合成に成功し,β-ガラクトシダーゼ活性を半分程度にまで抑制することができた。次に,がんの抑制に応用するために動物細胞内でアンチセンスDNAなどの任意の一本鎖DNAを合成するためのベクターの構築を目指した。動物細胞で用いる場合,核内で一本鎖DNAを合成したほうが良いのかそれとも細胞質内で合成したほうが良いのかがわからない。そこで,核内に逆転写酵素を移行させるためのベクターと細胞質内にとどめておくためのベクターの構築を行った。これまでのところ核内外で逆転写酵素の合成は認められていない。コントロールのGFP(green fluorescent protein)の発現量には問題がないため,逆転写酵素の動物細胞内での安定性などに問題があるのではないかと考えている。

利用细菌逆转录酶的msDNA（多拷贝单链DNA）合成系统目前被认为是在细胞内合成任意单链DNA（例如反义DNA）的唯一方法。在我们之前的研究中，我们开发了一种在细菌中合成反义DNA的载体，并成功抑制了特定基因的表达。另外，核酶是广义反义方法的一种，是具有RNA切割活性的RNA，并且已经报道了通过切割靶mRNA来抑制特定基因的表达的合成应用的例子。然而，由于核酶的切割识别序列在一定程度上受到限制，因此可能无法切割某些感兴趣的RNA。另一方面，DNA酶是具有RNA切割活性的DNA，并且对切割位点的识别序列没有与核酶相同的限制。因此，它有望得到广泛应用，但迄今为止尚未建立细胞内合成系统。在这项研究中，我们使用相同的载体成功地在细菌中合成了DNA酶，并且能够将β-半乳糖苷酶的活性抑制到一半左右。接下来，我们的目标是构建一个载体来合成任意单链DNA，例如动物细胞中的反义DNA，用于癌症抑制。当用于动物细胞时，目前尚不清楚是在细胞核中还是在细胞质中合成单链DNA更好。因此，我们构建了一个将逆转录酶转移到细胞核中的载体和一个将其保留在细胞质中的载体。迄今为止，尚未在细胞核内外观察到逆转录酶的合成。由于对照中GFP（绿色荧光蛋白）的表达水平没有问题，我们怀疑动物细胞中逆转录酶的稳定性可能存在问题。

项目成果

K.Yamanaka: "Mobile DNA II"ASM Press(in press). (2001)

K.Yamanaka：“Mobile DNA II”ASM Press（正在印刷中）。

B.Lampson: "The msDNAs of bacteria"Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.. 67. 65-91 (2001)

B.Lampson：“细菌的 msDNA”Prog。