細胞内アンチセンスDNA発現ベクターの開発とがんの遺伝子治療への応用

细胞内反义DNA表达载体的开发及其在癌症基因治疗中的应用

• 批准号: 12217095
• 负责人: 島本 整
• 金额: $ 2.88万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12217095/
• 关键词: 細菌逆転写酵素; アンチセンスDNA; msDNA; レトロン; 多剤耐性; ベクター

現在,特定の遺伝子の発現制御を行うためにアンチセンスRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する方法が一般的に用いられており,その技術は遺伝子組換え作物や病気の治療などに応用されつつある。しかし,発現量の多い遺伝子に対して十分な発現抑制を行うためにはかなり大量のアンチセンスRNAを細胞内で発現させたり,大量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する必要があるなど問題点も多い。これらの観点からアンチセンスDNAを細胞内で合成するベクターを開発すれば,多方面への応用が期待できる。細菌由来の逆転写酵素は,細胞内においてmsDNA(multicopy single-stranded DNA)と呼ばれる一本鎖RNAと一本鎖DNAの複合体の合成に必須の酵素である。このmsDNA合成系は,現在唯一細胞内で安定な一本鎖DNAを合成することのできる系である。そこで本研究においては,msDNA合成系を利用してアンチセンスDNAを細胞内で合成するためのベクターの開発とアンチセンス効果の検討を行った。まず,予備検討を行うために細菌内でアンチセンスDNAを合成させ,大腸菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)を標的として細胞内で合成したアンチセンスDNAの効果を調べた。その結果,最高85%の活性阻害が認められ,かなり効率の良い遺伝子発現制御系であることが確認できた。次いで,この系を利用して多剤耐性遺伝子の発現抑制を行ったところ薬剤耐性菌を感受性化することに成功した。現在は,この細胞内アンチセンスDNA合成法をがんの遺伝子治療に応用できるよう細菌逆転写酵素遺伝子とmsDNAコード領域を動物細胞用のベクターに移し,動物細胞内での効率のよいmsDNA合成系の開発を行っている。その際,アンチセンスDNAの効率のことを考えて,核内でmsDNAを合成するベクターと核外で合成するベクターの両者を構築している。

目前，通常使用反义RNA和反义寡核苷酸的方法来控制特定基因的表达，并且该技术正在应用于转基因作物和疾病治疗。然而，存在许多问题，例如需要在细胞中表达大量反义RNA并施用大量反义寡核苷酸以充分抑制高表达的基因的表达。从这些观点来看，在细胞内合成反义DNA的载体的开发有望具有许多应用。细菌逆转录酶是细胞内合成单链 RNA 和单链 DNA 复合物（称为 msDNA（多拷贝单链 DNA））的必需酶。该msDNA合成系统是目前唯一能够在细胞内合成稳定单链DNA的系统。因此，在本研究中，我们利用msDNA合成系统开发了一种用于细胞内合成反义DNA的载体，并研究了反义效果。首先，作为初步研究，在细菌中合成了反义DNA，并研究了在细胞中合成的反义DNA针对大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的效果。结果，观察到最大85%的活性抑制，证实这是一个相当有效的基因表达控制系统。接下来，通过利用该系统抑制多药耐药基因的表达，我们成功地使耐药细菌变得敏感。目前，为了将这种细胞内反义DNA合成方法应用于癌症基因治疗，我们已将细菌逆转录酶基因和msDNA编码区转移到动物细胞的载体上，并正在开发一种在动物细胞中高效的msDNA合成系统。正在开发中。目前，考虑到反义DNA的效率，我们正在构建在核内合成msDNA的载体和在核外合成msDNA的载体。