細胞内で合成した一本鎖DNAによる新規遺伝子発現制御法の開発

使用细胞内合成的单链DNA开发新型基因表达控制方法

• 批准号: 09770182
• 负责人: 島本 整
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Hiroshima University (1998)Okayama University (1997)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770182/
• 关键词: 逆転写酵素; cDNA; アンチセンスDNA; 大腸菌; 多剤耐性; 遺伝子発現制御

細菌逆転写酵素は,multicopy single-stranded DNA(msDNA)と呼ばれるRNA-DNA複合体の合成に必須の酵素であり,細胞内で安定な一本鎖DNAを合成可能な唯一の系として知られている.この系を利用することによって細胞内でアンチセンスDNAなどを合成し,新たな遺伝子発現制御系を構築することが可能である.従来より用いられているアンチセンスRNAによる遺伝子発現制御系は大量のRNAを発現させる必要があり効率が悪いが,アンチセンスDNAを利用した場合は,細胞内に存在するリボヌクレアーゼHが標的mRNAを分解可能であるためアンチセンスRNAより少量で効率良い遺伝子の発現抑制を行うことができる.これまでの研究で,アンチセンスDNAを大腸菌内である程度効果的に発現することには成功しているが,実用化するためにはまだ十分な発現抑制効率であるとはいえなかった.そこで,より効率的なアンチセンス DNAを発現するベクターを開発するためにin vitroのmsDNA合成系を利用して標的mRNAとハイブリダイズしやすい鋳型構造を検索した. その結果, cDNA合成のための鋳型領域とプライマー領域を分断しても効率良くcDNAが合成されることがわかった(論文発表).さらに,この結果に基づいて鋳型とプライマーを分断した構造のベクターを構築し,大腸菌内で効率良く cDNAを合成することに成功した.このベクターから合成されるcDNAは,一本鎖領域がRNAから遊離した状態で存在しているため,アンチセンス合成用ベクターとして適している.また,アンチセンス以外にも msDNAのステム部分の二本鎖を利用した転写制御因子の吸着や三重鎖DNAなどによる発現制御系の開発も現在進行中である.

细菌逆转酶是一种用于合成RNA-DNA复合物的多拷贝单链DNA（MSDNA）的必需酶，被称为唯一可以合成细胞中稳定的单链DNA的系统。通过使用该系统并构建一个新的基因表达控制系统，必须表达大量的RNA，但是使用抗sense DNA，则需要使用抗核酸，在细胞中构建了抗sense DNA等。细胞可以分解靶mRNA，因此小型和有效的基因的表达比抗强度的RNA更有效。 ，但仍然有足够的表达抑制效率来实践使用。结果，MSDNA的合成。通过基于此结果将霉菌和底漆划分的结构，从该载体合成的cDNA成功地在大肠杆菌中有效合成了cDNA，因此它适合作为抗敏感的合成载体，因为单个链式区域存在于RNA。除了反性外，目前正在使用三链DNA的双链链的转移控制因子的吸附，并且正在开发表达控制系统。

项目成果

Tadashi Shimamoto: "In vitro synthesis of multicopy single-stranded DNA,using separate primer and template RNAs,by Escherichia coli reverse transcriptase" Journal of Bacteriology. 180(11). 2999-3002 (1998)

Tadashi Shimamoto：“使用单独的引物和模板 RNA，通过大肠杆菌逆转录酶体外合成多拷贝单链 DNA”《细菌学杂志》。

Masayori Inouye: "In vivo production of oligonucleotides of specific sequences : application to antisense DNA" Chiba Foundation Symposium. 209. 224-233 (1997)

Masayori Inouye：“特定序列寡核苷酸的体内生产：反义 DNA 的应用”千叶基金会研讨会。

島本整: "細菌逆転写酵素とmsDNA" 化学と生物. 37(2). 93-102 (1999)

Sei Shimamoto：“细菌逆转录酶和 msDNA”化学与生物学 37(2) (1999)。