サルモネラ属菌由来のクエン酸輸送タンパク質の精製と高次構造の解析

沙门氏菌柠檬酸转运蛋白的纯化和高阶结构分析。

• 批准号: 07770198
• 负责人: 島本 整
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770198/
• 关键词: サルモネラ; クエン酸; 能動輸送; 変異株; ネズミチフス菌; 膜タンパク質; 高次構造; 共輸送

能動輸送は、細胞内の恒常性維持や栄養物の取り込み、有害物の排出などにおいて重要な役割を果たしている。しかしながら、その機能を担っている輸送タンパク質の高次構造と機能の関係については、いまだ不明な点が多い。本研究においては、ネズミチフス菌(Salmonella typhinmurium)のCitAクエン酸輸送タンパク質の基質認識が変化した変異株を分離し、その変異部位を同定することによってクエン酸輸送タンパク質の構造と機能の関係を解析した。通常CitAタンパク質が基質として認識できないイソクエン酸を利用できるようになった変異株を単離し、9株の変異アミノ酸残基を同定した。その結果、それぞれの変異株において単一アミノ酸残基の置換が認められ、計7カ所のアミノ酸残基に変異が見つかった(2株は同一アミノ酸残基の変異)。そして、それらのアミノ酸残基をCitAタンパク質の推定トポロジーモデル上に位置付けた。同定された変異アミノ酸残基は、一次構造上、隣接した位置に存在していなかったが、高次構造上基質認識部位またはその近傍に位置することが示唆された(論文投稿中)。本研究の結果より、輸送タンパク質の基質認識と高次構造(特に膜貫通領域とループ領域の関係)に関する重要な情報が得られた。現在タンパク質の高次構造を決定するための最も有力な方法は、X線結晶構造解析である。そのためには、輸送タンパク質を大量に精製し、結晶化する必要がある。一般的に、輸送タンパク質のような膜タンパク質の大量発現、精製は極めて困難であり、結晶化にいたってはほとんど成功例がない。本研究においてクエン酸輸送タンパク質の精製を行うことはできなかったが、今後は大量発現系を構築することによって輸送タンパク質の精製と詳細な高次構造の解析を目指したい。

主动转运在维持细胞内稳态、摄取营养物质和排出有害物质方面发挥着重要作用。然而，关于负责这些功能的转运蛋白的高阶结构和功能之间的关系仍然存在许多未知数。本研究分离出一株鼠伤寒沙门氏菌CitA柠檬酸转运蛋白底物识别发生改变的突变株，并通过鉴定突变位点，分析了柠檬酸转运蛋白的结构与功能之间的关系。我们分离了能够利用异柠檬酸（CitA 蛋白通常无法将异柠檬酸识别为底物）的突变菌株，并鉴定了九个菌株中的突变氨基酸残基。结果，在每个突变株中都观察到单个氨基酸残基的取代，并且在总共7个氨基酸残基中发现了突变(两个菌株在相同的氨基酸残基中具有突变)。然后他们将这些氨基酸残基定位在 CitA 蛋白的预测拓扑模型上。所鉴定的突变氨基酸残基在一级结构中并不彼此相邻，但建议位于高级结构中的底物识别位点处或附近（正在提交的论文）。这项研究的结果提供了有关转运蛋白的底物识别和高阶结构（特别是跨膜区和环区之间的关系）的重要信息。目前，确定蛋白质高阶结构最有效的方法是 X 射线晶体学。为此，需要大量纯化和结晶转运蛋白。一般来说，转运蛋白等膜蛋白的大规模表达和纯化极其困难，结晶几乎没有成功。虽然我们在本研究中未能纯化柠檬酸转运蛋白，但我们希望通过构建大规模表达系统来纯化转运蛋白并详细分析其高阶结构。