リポホスホグリカン合成への基質供給遮断によるLeishmania病原性の制御

通过阻断脂磷酸聚糖合成的底物供应来控制利什曼原虫毒力

• 批准号: 11877024
• 负责人: 川喜田 正夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11877024/
• 关键词: Leishmania; 糖ヌクレオチド輸送体; UDP-ガラクトース輸送体; 分裂酵母

(1)多くの生物種の間でUDP-ガラクトース輸送体(UGT)の配列を比較し、Leishmania UDP-ガラクトース輸送体の相同性クローニングのための情報を得る目的で、Schizosaccharomyces pombeのUGTのクローニングを行った。分裂酵母のUGTは、ヒトおよびマウスのUGTとの間で、それぞれ40%および43%のアミノ酸配列の相同性を示し、UGT欠損Lec8細胞中に導入、発現させたところ、UDP-Ga1輸送活性を示すことが明らかになった。(2)そこで、新たに明らかにされた分裂酵母UGTの配列を含めて、各種の糖ヌクレオチド輸送体の間で高度に保存された領域数カ所のアミノ酸配列数カ所を選定した。この配列に基づいてPCRプライマー(degenerated primer)を設計し、Leishmania DNAを鋳型として糖ヌクレオチド輸送体遺伝子のPCRクローニングを試行中であるが、現在までのところ、positive cloneは得られていない。(3)S.pombeのUGT欠損株Δgmslはバナジル酸感受性を示す。この変異表現型の相補を利用してLeishmania UGT遺伝子の発現クローニングを行うことが可能である。その目的で、分裂酵母発現ベクターを用いてLeishmaniaゲノムDNAライブラリーを作成した。現在、バナジル酸抵抗性クローンのスクリーニングを進めている。(4)糖ヌクレオチド輸送体の基質認識機構の解明を通じて、特異的阻害剤の分子設計のために有用な情報が得られる可能性がある。このような観点からUDP-Gal輸送体/CMP-シアル酸輸送体キメラ分子の基質認識特性について検討し、UDP-Galの識別に重要な役割を果たす膜貫通ヘリックスの存在を明らかにすることができた。

（1）比较了许多生物种类中的UDP-galactor（UGT）阵列，并获得了利什曼原虫UDP-Galacto运输的同源克隆的信息，schizosacachomyces pombe的UGT克隆到了。分裂酵母的UGT表明人类和小鼠UGT之间的40％和43％的氨基酸序列，并在UGT缺乏的LEC8细胞中引入和表达。 （2）有几个区域的氨基酸序列几个区域，它们在各种糖Nkleotides之间高度储存，包括新揭示的新揭示的酵母UGT的排列。设计了基于此阵列的PCR底漆（退化底漆），并试图用Leishmania DNA作为模具对糖核苷酸转运基因进行PCR克隆，但迄今为止尚未获得阳性克隆。 （3）ugt缺乏库存Δgmsl的s.pombe表示透镜酸的敏感性。可以使用这种突变表达类型补体对Leishmania ugt基因的表达克隆进行克隆。为此，使用分裂的酵母表达载体创建了利什曼原虫基因组DNA文库。目前，我们正在筛选透镜酸克隆。 （4）通过阐明糖核苷酸转运的底物识别机制，可以获得对特定抑制剂的分子设计的有用信息。从这个角度来看，可以揭示UDP-GAL转运/CMP-CMP-SIALIC酸转运分子分子的特征，并且存在在UDP-GAL鉴定中起重要作用的膜穿透螺旋。

项目成果

Yamamoto, Y. and Kawakita, M.: "Chemical modification of an arginine residue in the ATP-binding site of Ca^<2+>-transporting ATPase of sarcoplasmic reticulum by phenylglyoxal"Mol. Cell Biochem.. 190. 169-177 (1999)

Yamamoto, Y. 和 Kawakita, M.：“通过苯基乙二醛对肌浆网 Ca^2 转运 ATP 酶的 ATP 结合位点中的精氨酸残基进行化学修饰”Mol。

Ishida, N. et al.: "Indispensability of transmembrane domains of Golgi UDP-galactose transporter as revealed by analysis of genetic defects in UDP-galactose transporter-deficient murine Had-1 mutant cell lines and construction of deletion mutants"J. Bioch

Ishida, N. 等人：“通过分析 UDP-半乳糖转运蛋白缺陷型鼠 Had-1 突变细胞系的遗传缺陷和构建缺失突变体，揭示了高尔基体 UDP-半乳糖转运蛋白跨膜结构域的必要性”J.