糖ヌクレオチド輸送体を介する糖鎖リモデリングの基礎研究

糖核苷酸转运蛋白介导的聚糖重塑的基础研究

• 批准号: 10178220
• 负责人: 川喜田 正夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10178220/
• 关键词: 糖ヌクレオチド輸送体; UDP-GleNAc輸送体; UDP-Gal輸送体; CMP-シアル酸輸送体; ゴルジ装置

1. 新規糖ヌクレオチド輸送体のcDNAクローニングと発現(1) UDP-Gal輸送体関連遺伝子一つであるUGTrel2cDNAについて、その全長の配列を確定した。さらに、これを出芽酵母Saccharomyces cerevisiae細胞中で発現させることに成功し、UGTrel2 cDNA産物がUDP-GlcNAcを特異的に輸送すること、すなわち、UGTrel2がヒトUDP-GlcNAc輸送体遺伝子であることを明らかにした。このcDNAを発現ベクターpMKIT-neoに挿入してCHO細胞に導入することにより、輸送体タンパク質はゴルジ膜に局在化することが明らかになった。UDP-GlcNAc輸送体mRNAは、各種の臓器に普遍的に発現していることが示された。(2)分裂酵母Schizosaccharomyces pombeのUDP-Gal輸送体遺伝子が2個のexonから構成されていることを明らかにし、RT-PCRによってUDP-Gal輸送体cDNAのコード領域全長の配列を明らかにした。さらに、このコード領域をpMKIT-neoに挿入してUDP-Gal輸送体欠損Lec8細胞中で発現させ、変異表現型の相補を利用して、cDNA産物がUDP-Gal輸送機能をもつことを証明することができた。2. 糖ヌクレオチド輸送体の機能領域の解析UDP-Gal輸送体とCMP-シアル酸輸送体のキメラ分子を種々構築し、その発現およびUDP-Gal輸送機能について検討した結果、N末およびC末の推定ループ部分には互換性が認められた。これは、delektionの導入による機能解析の結果ともconsistentであった。一方、N末端に最も近い推定膜貫通へリックスの置換は、UDP-Gal輸送活性を失わせるとともに、輸送体タンパク質の細胞内における安定性を大きく損なうことが示された。

1.新型糖核苷酸转运蛋白的cDNA克隆和表达 (1)我们确定了UDP-Gal转运蛋白相关基因之一UGTrel2 cDNA的全长序列。此外，我们成功地在芽殖酵母酿酒酵母细胞中表达该基因，并证明UGTrel2 cDNA产物特异性转运UDP-GlcNAc，即UGTrel2是人UDP-GlcNAc转运蛋白基因。通过将该cDNA插入表达载体pMKIT-neo并将其导入CHO细胞，结果表明转运蛋白定位于高尔基体膜。 UDP-GlcNAc 转运蛋白 mRNA 在各种器官中普遍表达。 (2)揭示了裂殖酵母裂殖酵母的UDP-Gal转运蛋白基因由两个外显子组成，并通过RT-PCR测定了UDP-Gal转运蛋白cDNA编码区的全长序列。此外，我们将该编码区插入pMKIT-neo中，在UDP-Gal转运蛋白缺陷的Lec8细胞中表达，并利用突变表型的互补来证明cDNA产物具有UDP-Gal转运功能。那。 2.糖核苷酸转运蛋白功能区分析我们构建了各种UDP-Gal转运蛋白和CMP-唾液酸转运蛋白的嵌合分子，并研究了它们的表达，并在估计环部分发现了UDP-Gal转运功能的兼容性。这也与使用缺失进行功能分析的结果一致。另一方面，替换最接近 N 末端的假定跨膜螺旋可消除 UDP-Gal 转运活性，并显着损害转运蛋白的细胞内稳定性。

项目成果

Kawakita,M.: "Nuclcotide sugar transpotrers:Elucidation of their molecular identity and its implication for future studies" J.Biochem.123. 777-785 (1998)

Kawakita,M.：“核苷酸糖转运蛋白：阐明其分子特性及其对未来研究的意义”J.Biochem.123。