ウイルス増殖にかかわる宿主細胞因子の解析

病毒增殖相关宿主细胞因素分析

• 批准号: 07670161
• 负责人: 川喜田 正夫
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07670161/
• 关键词: ウイルス抵抗性変異細胞; パラミクソウイルス; ニューカッスル病ウイルス; UDP-ガラクトース輸送体; インターフェロン

1.UDP-カラクトース輸送体(UGT)欠損細胞Had-1の欠損の相補に関係するヒト遺伝子の断片からexon trap法によって単離されたDNA(152bp)をプローブとしてヒトTIG細胞cDNAライブラリーをスクリーニングし、約1kbのcDNA断片を得た。RACE(rapid amplification of cDNA ends)法によって3'末端および5'末端方向への伸長をはかり、最終的に393アミノ酸残基のORFをもつ2.6kbのcDNAの構造を確定することができた。このORF部分を発現ベクターpMKITneoに組み込んだpMKITneo/UGTプラスミドをHad-1にトランスフェクトしたところ、Had-1のレクチン感受性(GS-II^s, WGA^r)が形質転換体では親株FM3Aと同様のGS-II^r, WGA^sに復帰した。また、ニューカッスル病ウイルスに対する感受性も同時に復帰することが認められた。これらの結果に基づいて、我々が単離したcDNAがUGT cDNAであることが確認された。糖ヌクレオチド輸送体は糖転移酵素と並んで細胞表面糖鎖合成およびその制御に重要な役割を果たしていると考えられるが、従来その構造が解明されたものはなかった。UGT cDNAの単離と構造決定はその意味で画期的であり、ウイルス増殖関連遺伝子の分野のみならず、糖鎖生物学の分野においても大きな意味を持つ成果である。2.以下の事実に基づいて、IFNによるHad-2細胞中のNDV複製阻害の標的がmRNAの翻訳段階であることを明らかにした。NDV感染初期におけるNDV mRNA合成はHad-2細胞中では30-40%阻害されるが、NDV複製の完全阻害を説明するには不十分である。このmRNA合成阻害はcycloheximide(CHX)の添加によって回復し、CHX存在下感染3h後にはFM3A, Had-2両細胞中にほぼ同量のNDV mRNAが蓄積する。この時点でCHXを除去したところ、FM3A細胞中ではNDVタンパク質の合成が認められたが、Had-2細胞中では認められず、翻訳不全が示された。細胞性のタンパク質合成に関しては両細胞の間に差はなかった。

1.使用通过外显子捕获方法从与UDP-半乳糖转运蛋白(UGT)缺陷细胞中的Had-1缺失互补相关的人类基因片段中分离的DNA(152bp)筛选人TIG细胞cDNA文库。获得大约1 kb。利用RACE（cDNA末端快速扩增）方法，我们测量了向3'端和5'端的延伸，最终确定了具有393个氨基酸残基的ORF的2.6kb cDNA的结构。当用该ORF部分整合到表达载体pMKITneo中的pMKITneo/UGT质粒转染Had-1时，发现Had-1的凝集素敏感性(GS-II^s，WGA^r)与Had-1相似。 GS-II^r 中的亲本菌株 FM3A 返回到 WGA^s。还观察到对新城疫病毒的易感性同时恢复。基于这些结果，我们分离的cDNA被确认为UGT cDNA。糖核苷酸转运蛋白与糖基转移酶一起被认为在细胞表面糖链的合成和调节中发挥重要作用，但其结构尚未阐明。从这个意义上说，UGT cDNA的分离和结构测定是开创性的，不仅在病毒复制相关基因领域而且在糖生物学领域都是一项具有重大意义的成就。 2.基于以下事实，我们发现IFN诱导抑制Had-2细胞中NDV复制的目标是mRNA翻译步骤。在NDV感染早期，Had-2细胞中NDV mRNA合成被抑制30-40%，但这不足以解释NDV复制的完全抑制。这种对 mRNA 合成的抑制可通过添加放线菌酮 (CHX) 来逆转，并且在 CHX 存在的情况下感染后 3 小时，FM3A 和 Had-2 细胞中会积累大约相同量的 NDV mRNA。当此时去除 CHX 时，在 FM3A 细胞中观察到 NDV 蛋白合成，但在 Had-2 细胞中未观察到，表明翻译失败。两种细胞之间的细胞蛋白质合成没有差异。

项目成果

Ono, A.: "Conformational abberance of Sendai virus Fo protein in thapsigargin-treated cells allowing exit from the endoplasmic reticulum but causing arrest at the Golgi complex" J. Biochem.118. 1248-1254 (1995)

Ono, A.：“毒胡萝卜素处理的细胞中仙台病毒 Fo 蛋白的构象异常，允许从内质网退出，但导致在高尔基复合体处停滞”J. Biochem.118。