糖ヌクレオチド輸送体を介する糖鎖リモデリングの基礎研究

糖核苷酸转运蛋白介导的聚糖重塑的基础研究

• 批准号: 12033222
• 负责人: 川喜田 正夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12033222/
• 关键词: 糖ヌクレオチド輸送体; UDP-ガラクトース輸送体; CMP-シアル酸輸送体

糖ヌクレオチドによる特異的基質の認識の機構を明らかにする目的で、2種類の基質特異的輸送体UDP-ガラクトース(UGT)およびCMP-シアル酸輸送体(CST)の間のキメラを種々構築し、それらの輸送特性について詳しく検討した。UGT/CSTキメラ輸送体のUGT活性、CST活性を迅速に評価する方法として、我々は、UGT欠損Lec8細胞およびCST欠損Lec2細胞中でキメラcDNAを発現させ、特異抗体を用いた免疫蛍光染色によってキメラ輸送体を検出すると同時に、個々の発現細胞への蛍光標識レクチン(GS-IIおよびPNA)の結合の有無によってその輸送体の輸送活性の有無を評価する簡便な方法を開発した。そして、UGTとCSTの間では、特定の領域のdomain swappingによって一方から他方への基質特異性の変換をもたらすような領域は同定できないことを示し、その原因はUDP-Gal認識領域とCMP-NeuAc認識領域が異なるためであることを明らかにした。すなわち、10本の膜貫通ヘリックスH1-H10の内、H1,H8-H10がUGT由来のものであればキメラ輸送体はUGT活性を示し、また、H2,H3,H7がCST由来であれば残りのヘリックスがどちらに由来するものであっても輸送体はCST活性を示すこと、この二つの条件を同時に満たすものはUDP-Gal/CMP-NeuAc二重特異的輸送活性を示すことが明らかになった。このことをさらに直接的に示すため、我々はUGTのH2,H3,H7をCST由来の配列で置換したキメラ分子を酵母のミクロソーム膜に発現させ、膜小胞を単離して放射性標識基質の輸送を直接測定することにより、キメラ輸送体がUDP-Gal,CMP-NeuAcの両者を輸送できることを実証した。そしてさらに、両者が共通のチャンネルを利用して利用されること、また、UDP-GlcNAc,UDP-Glc等はこのキメラ輸送体とは相互作用しないことを明らかにした。

为了阐明由于糖核苷酸引起的特定底物识别的机制，建立了两种类型的底物特异性运输UDP-galactor（UGT）和CMP-CMP-CYCLACTOR（CST）之间的各种类型的嵌合体详细。为了快速评估UGT/CST嵌合体转运的UGT活性和CST活性，我们在UGT缺陷的LEC8细胞和CST缺陷的LEC2细胞中具有一个嵌合体cDNA，并使用特定的抗体使用免疫荧光。作为检测运输，我们开发了一种简单的方法来评估是否存在荧光凝集素（GS-II和PNA）与单个表达细胞的结合，并评估运输的运输活性的存在或不存在。在UGT和CST之间，它表明特定区域中的域交换无法识别可以将底物特异性从一个转换为另一个区域，原因是UDP-GAL识别区域和CMP-NEUAC识别区域不同。换句话说，如果H1和H8-H10源自10个膜螺旋H1-H10中的UGT，则嵌合体的运输显示出UGT活性，并且H2，H3，H7是从CST中得出的螺旋是衍生的，运输显示CST活性，很明显，满足这两个条件的同时具有双重特异性UDP-GAL/CMP-NEUAC。为了进一步表明这一点，我们在酵母微膜膜中表达具有CST序列的UGT H2，H3，H7，孤​​立的，孤立的和运输的放射性迹象，我们证明了嵌合体的运输能力。此外，已经揭示了两者均使用公共通道使用，并且UDP-GLCNAC，UDP-GLC等都不与Chimera运输相互作用。

项目成果

Muraoka,M. et al.: "Molecular characterization of human UDP-glucuronic acid /UDP-N-acetylglucosamine transporter, a novel nucleotiue sugar transporter with dual substrate specificity."FEBS Lett.. (印刷中). (2001)

Muraoka, M. 等人：“人 UDP-葡萄糖醛酸/UDP-N-乙酰葡糖胺转运蛋白的分子特征，一种具有双底物特异性的新型核糖转运蛋白。”FEBS Lett..（出版中）。

Segawa,H. et al.: "Functional analysis of the individual oligosaccharid chains of Sendal virus fusion protein"J.Biochem.. 128. 65-72 (2000)

濑川，H.