膜タンパク質結晶化の支援法の開発-ABCタンパク質を中心に

膜蛋白结晶支持方法的开发——以ABC蛋白为中心

基本信息

批准号：
11169222
负责人：
加藤博章
金额：
$ 1.66万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)ペルオキシソームのABCトランスポーターALDPとPMP70のATP結合ドメインとマルトース結合タンパク質MBPとの融合タンパク質の結晶化を行うため、ALDPとPMP70とMBPとの融合タンパク質を大腸菌にて発現させて精製し動的光散乱を用いて結晶化に対する適性を判別した。しかし、残念ながらいずれも結晶化には適さない会合体であることが判明した。そこで、大腸菌以外の発現系を用いる系の検討を始めた。(2)ラットのMDRとSUR1を昆虫細胞SF-9を用いて発現させるシステムを構築した。その結果、ウエスタンブロットで発現を確認することができた。そこで、界面活性剤の適性を調べるとともに、小スケールでの精製を試みた。(3)糖鎖構造の詳細が解明されているリンゴ銀葉病菌由来ポリガラクチュロナーゼを用いて糖鎖の構造が結晶化に及ぼす影響の把握を試みた。その結果、糖鎖構造の存在は問題とならないが、構造の多様性がある場合には結晶化の障害となることが実験的に確認できた。すなわち、糖鎖構造に多様性がある場合は、動的光散乱による分子サイズの分布が多分散の様相を示し、結晶化を行っても結晶が得られないことがわかった。一方、結晶化できた、修飾糖鎖構造が単純な酵素は、X線結晶構造解析を行うことにおり、その三次元構造を明らかにすることができた。この結晶は、SPring-8のシンクロトロン放射光X線を用いた場合0.96Åを越える分解能を有しており、ARP/wARPプログラムを用いることにより、自動的に分子モデルを構築することができた。

(1)为了结晶过氧化物酶体ABC转运蛋白ALDP、PMP70的ATP结合结构域和麦芽糖结合蛋白MBP的融合蛋白，在大肠杆菌中表达ALDP、PMP70和MBP的融合蛋白，纯化，并激活定向光散射来确定结晶的适用性。然而不幸的是，事实证明所有这些聚集体都不适合结晶。因此，我们开始研究使用大肠杆菌以外的表达系统的系统。 (2)我们利用昆虫细胞SF-9构建了表达大鼠MDR和SUR1的系统。结果，可以通过Western印迹证实表达。因此，我们研究了表面活性剂的适用性并尝试了小规模纯化。 (3)我们尝试使用来自苹果银叶细菌的多聚半乳糖醛酸酶来了解糖链结构对结晶的影响，该酶的糖链结构已被详细阐明。结果，实验证实糖链结构的存在不是问题，但结构多样性成为结晶的障碍。换句话说，发现当糖链结构存在多样性时，通过动态光散射测定的分子尺寸分布表现出多分散的方面，并且即使进行结晶也不能获得晶体。另一方面，我们对能够结晶的简单修饰糖链结构的酶进行了X射线晶体结构分析，并能够阐明其三维结构。在 SPring-8 上使用同步辐射 X 射线时，该晶体的分辨率超过 0.96 Å，并且可以使用 ARP/warP 程序自动构建分子模型。

项目成果

期刊论文数量（1）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

中津亨: "構造機能の相同性とアミノ酸配列の非相同性"化学と生物. 37. 487-491 (1999)

Toru Nakatsu：“结构功能同源性和氨基酸序列非同源性”化学与生物学 37. 487-491 (1999)。

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