迅速冷却によるグルタチオン合成酵素反応中の準安定構造のX線結晶解析

快速冷却谷胱甘肽合成酶反应过程中亚稳态结构的 X 射线晶体学

基本信息

批准号：
06760085
负责人：
加藤博章
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760085/
关键词：
迅速冷却グルタチオン合成酵素酵素反応 X線結晶解析

项目摘要

1.グルタチオン合成酵素にγグルタミルシステイン依存性ATP加水分解活性があることを見いだした。この活性は、通常本来のグルタチオン合成活性の2%以下に押さえられているものの、活性中心を覆っていると考えられるフレキシブルループを削除することによってその割合が上昇した。すなわち、フレキシブルループは、アシルリン酸中間体とグリシンとの反応を制御していると考えられる。2.このATP加水分解活性に注目し、反応途中の酵素基質複合体をX線結晶解析で捕捉することを目的として以下の系を構築した。すなわち、caged-ATPと呼ばれる光照射によって外れる保護基を導入されたATPとγグルタミルシステインをグルタチオン合成酵素と共存させて結晶化し、得られた複合体酵素の結晶にフラッシュを照射することで反応を開始直後、結晶を迅速に冷却することによって反応を停止させ、その状態をX線結晶構造解析するものである。(1)結晶中においてグルタチオン合成酵素によって触媒されるγグルタミルシステイン依存性のATP加水分解反応を、HPLCを用いて定量した。次いで、グルタチオン合成酵素とcaged-ATP及びγグルタミルシステインとの複合体結晶を作成し、フラッシュフォトリシスによってcaged-ATPからATPを放出させた後、20℃にて反応させたところ、結晶状態のグルタチオン合成酵素によって、70時間後に60%のATPがADPに、4日後には、90%のATPがADPに変換されていることが判明した。(2)反応開始直後と反応終了時の結晶を0℃に冷やすことでほぼ反応を停止させ、その状態のX線回折強度を測定した。その結果、酵素によって加水分解される直前のATPの構造を捉えることに成功した。また、ATPの加水分解にともない166番目と167番目のグリシン残基が大きく構造変化することが観測された。

1.我们发现谷胱甘肽合酶具有γ-谷氨酰半胱氨酸依赖性ATP水解活性。尽管这种活性通常被抑制到原始谷胱甘肽合成活性的 2% 以下，但通过删除被认为覆盖活性中心的柔性环，该比率得以增加。也就是说，柔性环被认为控制酰基磷酸中间体和甘氨酸之间的反应。 2.针对ATP水解活性，我们构建了以下系统，旨在通过X射线晶体学捕获反应过程中的酶-底物复合物。具体来说，ATP（具有可通过光照射去除的被称为笼状-ATP的保护基团）和γ-谷氨酰半胱氨酸在谷胱甘肽合成酶的共存下结晶，并且用闪光灯照射所得的复合酶晶体以引发反应开始后，立即通过快速冷却晶体来停止反应，并通过X射线晶体结构分析来分析所得状态。 (1)使用HPLC对晶体中谷胱甘肽合成酶催化的γ-谷氨酰半胱氨酸依赖性ATP水解反应进行定量。接下来，制作了谷胱甘肽合成酶、笼状-ATP和γ-谷氨酰半胱氨酸的复合晶体，通过闪光光解从笼状-ATP中释放出ATP后，在20℃下进行反应，得到结晶状谷胱甘肽。发现70小时后60%的ATP被合成酶转化为ADP，4天后90%的ATP转化为ADP。 (2)在反应开始后和反应结束时将结晶冷却至0℃，使反应几乎停止，测定该状态下的X射线衍射强度。结果，他们成功捕获了 ATP 被酶水解之前的结构。此外，还观察到第 166 位和第 167 位甘氨酸残基因 ATP 水解而发生重大结构变化。

项目成果

期刊论文数量（1）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

加藤博章: "Flexible Loop That Is Novel Catalytic Machinery in a Ligase. Atomic Structure and Function of the Loopless Glutathione Synthetase" Biochemistry. 33. 4995-4999 (1994)

Hiroaki Kato：“柔性环是连接酶中的新型催化机制。无环谷胱甘肽合成酶的原子结构和功能”生物化学 33. 4995-4999 (1994)。

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