ゲンジボタル・ルシフェラーゼ反応中間体アナログ複合体のX線結晶構造解析

源氏萤火虫荧光素酶反应中间体类似物复合物的X射线晶体结构分析

基本信息

批准号：
12045269
负责人：
加藤博章
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本計画の目標は、ルシフェラーゼと反応中間体アナログ、アデニル化デヒドロルシフェリンとの複合体のX線結晶構造解析を行い、アデニル化ルシフェリンの結合様式の構造的な基盤を明らかにすることにある。そして、その結果に基づいて、さらに次の反応段階を捉えるための鍵となる新たな中間体アナログのデザインを行おうとするものである。そこで、デヒドロルシフェリンとATPをルシフェラーゼと混合して反応させた後、沈殿剤を加えて結晶化を行ったところ、ポリエチレングリコールを沈殿剤として良質の結晶を得ることができた。そこで、SPring-8のシンクロトロン放射光をX線源としてX線結晶解析を行ったところ、1.7Å分解能のX線回折強度データの収集に成功した。得られたデータとすでに解析したルシフェラーゼ-ATP複合体の立体構造モデルを初期構造として、分子置換法による構造解析を行ったところ、有意な解を見つけることができた。現在、構造モデルの精密化を行っている。デヒドロルシフェリンの結合部位は、ATPのαリン酸残基結合位置の近傍にある洞穴状のくぼみの中にあり、結合部位を構成しているアミノ酸残基は、疎水性の側鎖を有するものがほとんどであった。このことは、従来分光学的な実験から予想されてきたルシフェリン結合部位の特徴と良く一致している。しかし、ATP部分の電子密度が鮮明なことと比較してデヒドロルシフェリン部分の電子密度はぼやけており、結合したデヒドロルシフェリンは動きやすいことが示唆された。

该项目的目标是分析荧光素酶与反应中间体类似物腺苷酸化脱氢荧光素之间的复合物的X射线晶体结构，并阐明腺苷酸化荧光素结合模式的结构基础。根据结果，我们的目标是设计新的中间类似物，这将是理解下一步反应的关键。因此，当脱氢荧光素和ATP与荧光素酶混合反应时，加入沉淀剂进行结晶，以聚乙二醇作为沉淀剂，得到了高质量的晶体。因此，我们利用SPring-8的同步加速器辐射作为X射线源进行X射线晶体分析，并成功收集了分辨率为1.7 Å的X射线衍射强度数据。利用获得的数据和之前分析的荧光素酶-ATP复合物的三维结构模型作为初始结构，我们利用分子置换法进行结构分析，并能够找到有意义的解决方案。我们目前正在完善结构模型。脱氢荧光素的结合位点位于ATP的α-磷酸残基结合位点附近的洞穴状空腔中，构成结合位点的氨基酸残基几乎都是具有疏水性侧链的。这与传统光谱实验预测的荧光素结合位点的特征非常吻合。然而，与 ATP 部分的清晰电子密度相比，脱氢荧光素部分的电子密度是模糊的，表明结合的脱氢荧光素是可移动的。

项目成果

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F.Yokokawa