合成酵素によるATPの基質活性化機構-アスパラギン合成酵素のX線結晶解析

合成酶的 ATP 底物激活机制 - 天冬酰胺合成酶的 X 射线晶体分析

基本信息

批准号：
07660110
负责人：
加藤博章
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、反応機構を異にする2つの合成酵素のX線結晶構造を基に、合成酵素がいかにATPを用いて基質を活性化しているかを明らかにすることにある。そこで、1)アスパラギン合成酵素のX線結晶構造解析を行い、同酵素の基質認識機構を原子レベルで解析するとともに、2)結晶構造を我々の手で解析したグルタチオン合成酵素と比較することにより、両酵素のATP認識機構の共通点と相違点を三次元構造に基づいて明らかにした。まず、アスパラギン合成酵素のX線結晶構造を2.7Åで決定した。解析は、白金およびサマリウム誘導体結晶を用いた多重同型置換法を用いて行った。得られた、立体構造は、酵母由来のアルパラギン酸tRNA合成酵素の活性ドメインと非常によく似ていた。ところが、両酵素のアミノ酸配列(一次構造)は、ほとんど類似性がない。しかし、立体構造に基づいてアミノ酸配列を比較したところ、活性中心を構成しているアミノ酸残基だけが保存されていることが判明した。両酵素は、いずれもATPのαリン酸基を用いてアスパラギン酸のカルボキシル基を活性化するという共通の化学反応機構を有することから、これら酵素は、ある単純な化学反応を触媒する祖先タンパク質から基質特異性を獲得しつつ変異を繰り返して立体構造を維持しながら進化してきたと考えられる。次に、ATP結合部位について、グルタチオン合成酵素との比較を行ったところ、両酵素とも、ATP結合部位は逆平行βシート構造で構成されているという類似性があった。しかし、グルタチオン合成酵素では、ATPのγリン酸基を基質へと転移可能な位置に基質の結合部位があるのに対して、アスパラギン合成酵素では、ATPがαリン酸基の位置でくの字に曲がりαリン酸基へと基質が攻撃しやすいようになっているという違いが判明した。

本研究的目的是基于两种具有不同反应机制的合成酶的 X 射线晶体结构，阐明合成酶如何利用 ATP 来激活其底物。因此，我们1）对天冬酰胺合成酶进行了X射线晶体结构分析，并在原子水平上分析了该酶的底物识别机制，2）将其晶体结构与我们手工分析的谷胱甘肽合成酶的晶体结构进行了比较，我们澄清了这一点。基于其三维结构，两种酶的 ATP 识别机制的异同。首先，确定天冬酰胺合酶的 X 射线晶体结构为 2.7 Å。该分析采用铂和钐衍生物晶体的多重同构置换法进行。由此产生的三维结构与酵母源天冬氨酸 tRNA 合成酶的活性结构域非常相似。然而，两种酶的氨基酸序列（一级结构）几乎没有相似性。然而，当根据其三维结构比较氨基酸序列时，发现只有组成活性中心的氨基酸残基是保守的。这两种酶具有共同的化学反应机制，即利用 ATP 的 α-磷酸基团激活天冬氨酸的羧基，因此这些酶源自催化简单化学反应的祖先蛋白质，人们认为它是在保持其三个化学反应的同时进化的。通过重复突变获得三维结构，同时获得底物特异性。接下来，我们将ATP结合位点与谷胱甘肽合成酶的结合位点进行比较，发现两种酶有相似之处，即ATP结合位点由反向平行的β-折叠结构组成。然而，在谷胱甘肽合成酶中，底物结合位点位于ATP的γ-磷酸基团可以转移到底物的位置，而在天冬酰胺合酶中，ATP位于α-磷酸基团的位置。是底物向α-磷酸基团弯曲，使得底物更容易攻击。

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

T. Nakatsu, H. Kato, J. Oda: "Crystallization and Preliminary Crystallogrophic Study of Asparagine Symthetase from Escherichia coli" Acta Crystallogr. D. (印刷中).

T. Nakatsu、H. Kato、J. Oda：“大肠杆菌天冬酰胺合成酶的结晶和初步结晶研究”Acta Crystallogr D.（出版中）。

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