合成酵素によるATPの基質活性化機構-アスパラギン合成酵素のX線結晶解析

合成酶的 ATP 底物激活机制 - 天冬酰胺合成酶的 X 射线晶体分析

基本信息

批准号：
07660110
负责人：
加藤博章
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、反応機構を異にする2つの合成酵素のX線結晶構造を基に、合成酵素がいかにATPを用いて基質を活性化しているかを明らかにすることにある。そこで、1)アスパラギン合成酵素のX線結晶構造解析を行い、同酵素の基質認識機構を原子レベルで解析するとともに、2)結晶構造を我々の手で解析したグルタチオン合成酵素と比較することにより、両酵素のATP認識機構の共通点と相違点を三次元構造に基づいて明らかにした。まず、アスパラギン合成酵素のX線結晶構造を2.7Åで決定した。解析は、白金およびサマリウム誘導体結晶を用いた多重同型置換法を用いて行った。得られた、立体構造は、酵母由来のアルパラギン酸tRNA合成酵素の活性ドメインと非常によく似ていた。ところが、両酵素のアミノ酸配列(一次構造)は、ほとんど類似性がない。しかし、立体構造に基づいてアミノ酸配列を比較したところ、活性中心を構成しているアミノ酸残基だけが保存されていることが判明した。両酵素は、いずれもATPのαリン酸基を用いてアスパラギン酸のカルボキシル基を活性化するという共通の化学反応機構を有することから、これら酵素は、ある単純な化学反応を触媒する祖先タンパク質から基質特異性を獲得しつつ変異を繰り返して立体構造を維持しながら進化してきたと考えられる。次に、ATP結合部位について、グルタチオン合成酵素との比較を行ったところ、両酵素とも、ATP結合部位は逆平行βシート構造で構成されているという類似性があった。しかし、グルタチオン合成酵素では、ATPのγリン酸基を基質へと転移可能な位置に基質の結合部位があるのに対して、アスパラギン合成酵素では、ATPがαリン酸基の位置でくの字に曲がりαリン酸基へと基質が攻撃しやすいようになっているという違いが判明した。

这项研究的目的是阐明合成酶如何使用ATP基于两个具有不同反应机制的合成酶的X射线晶体结构来激活底物。因此，通过1）对天冬酰胺合酶进行X射线晶体结构分析，分析酶在原子水平上的底物识别机制，以及2）将晶体结构与谷胱甘肽合酶进行比较，我们通过动手进行了分析，我们阐明了基于ATP识别机制之间的共同点和差异。首先，在2.7Å处确定天冬酰胺合酶的X射线晶体结构。使用铂和衍生晶体的多种同构替代法进行了分析。所得的三维结构与酵母衍生的过甲酸ATRNA合酶的活性结构域非常相似。但是，这两种酶的氨基酸序列（主要结构）几乎不令人满意。但是，当比较基于三维结构的氨基酸序列时，发现只有构成活性中心的氨基酸残基才能保守。两种酶都有一种常见的化学反应机制，该机制使用ATP的α-磷酸基团激活天冬氨酸的羧基，因此，人们认为这些酶通过从祖先蛋白中获取底物特异性而发展而来，从而催化了一种简单的化学反应，反复突变并维护其三副词结构。接下来，将ATP结合位点与谷胱甘肽合酶进行比较时，发现这两种酶都有相似性，因为ATP结合位点由反平行的β-折叠结构组成。然而，差异是在谷胱甘肽合酶中发现的，而底物在可以将ATP的γ磷酸磷酸基团绑定到底物的位置，而在天冬酰胺合酶中，ATP在α磷酸盐组的位置处于U弯曲的位置，从而使底物更可能攻击α磷酸组。

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

T. Nakatsu, H. Kato, J. Oda: "Crystallization and Preliminary Crystallogrophic Study of Asparagine Symthetase from Escherichia coli" Acta Crystallogr. D. (印刷中).

T. Nakatsu、H. Kato、J. Oda：“大肠杆菌天冬酰胺合成酶的结晶和初步结晶研究”Acta Crystallogr D.（出版中）。

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