X線解析を目指した多剤耐性ポンプMDR1の大量発現系の構築と結晶化

用于X射线分析的多药耐药泵MDR1大规模表达系统的构建和结晶

基本信息

批准号：
16659012
负责人：
加藤博章
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトの多剤耐性ポンプMDR1を対象として、X線結晶構造解析を目的とした結晶化を達成することを目的として以下の研究を行なった。1.X線結晶解析に適したMDRl結晶の調製結晶化条件探索を広範囲に拡大するため、更なる大量生産系を構築した。すなわち、30リットル/1ヶ月の培養ペースで連続して安定な生産が可能になった。さらに、精製蛋白質の質的改善を目指し、構造安定性の向上に寄与する界面活性剤を検索した。約20種類の界面活性剤を検討した結果、1つの界面活性剤が新たに見つかった。一方、結晶化能を向上させると予想される2種類の部位特異的変異導入蛋白質を大量発現、精製することに成功した。得られた精製標品を用いて結晶化を行なったところ、微針状結晶からキューブ状の微結晶が得られた。しかし、X線を照射してもX線回折像は得られなかった。さらに改良を検討している。2.Fab複合体調製による結晶化の支援MDR1の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を入手して検索した結果、立体構造特異的な結合をしていると示唆されるFab断片を得ることができた。そして、MDR1との複合体を形成していることがゲル濾過から示された。3.膜蛋白質の結晶化能を把握する手法の確立可溶性蛋白質では、精製した蛋白質溶液の動的光散乱分析により分子量分布の狭い試料は結晶化の可能性が高いことが知られている。そこで、膜タンパク質における同様の方法を検討した。その結果、電子顕微鏡を用いた蛋白質分子の直接観察およびゲル濾過法の利用により、界面活性剤の存在下でも分子量分布の広狭の違いを観測することが可能になった。

进行以下研究是为了实现X射线晶体结构分析的结晶，以实现人类多药耐药泵MDR1的目的。 1。制备适合X射线晶体学的MDRL晶体，以广泛扩大搜索结晶条件，构建了额外的质量生产系统。换句话说，每月30升的文化速度可以进行连续和稳定的生产。此外，我们搜索了有助于改善结构稳定性的表面活性剂，以改善纯化蛋白质的定性改善。在检查了大约20种类型的表面活性剂后，发现了一种新的表面活性剂。另一方面，我们已经成功表达和纯化了大量的两种位置定向的诱变蛋白，这些诱变蛋白有望提高结晶能力。获得的纯化制剂用于结晶，并从微针晶体获得了立方体样微晶。但是，即使使用X射线照射，也没有获得X射线衍射图像。我们正在考虑进一步的改进。 2。通过制备Fab复合物来支撑结晶。搜索了MDR1细胞外域的单克隆抗体，并且Fab片段表明它们具有特异性结合。凝胶过滤还表明它与MDR1形成了复合物。 3。建立一种方法来掌握膜蛋白在可溶性蛋白中的结晶能力，众所周知，具有窄分子量分布的样品极有可能基于纯化蛋白质溶液的动态光散射分析来结晶。因此，研究了一种类似的膜蛋白方法。结果，使用电子显微镜和凝胶过滤方法直接观察蛋白质分子，即使在存在表面活性剂的情况下，也可以观察到分子量分布的广泛和狭窄差异。

项目成果

期刊论文数量（16）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Crystal structures of pyruvate phosphate dikinase from maize revealed an alternative conformation in the swiveling-domain motion.

DOI：
10.1021/bi0484522
发表时间：
2005-02
期刊：
Biochemistry
影响因子：
2.9
作者：
T. Nakanishi;T. Nakatsu;M. Matsuoka;K. Sakata;H. Kato
通讯作者：
T. Nakanishi;T. Nakatsu;M. Matsuoka;K. Sakata;H. Kato

ABC蛋白質の立体構造研究-現状と課題-ABC蛋白質(植田和光編)

ABC蛋白的三维结构研究 - 现状与问题 - ABC蛋白（上田一光主编）

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
影响因子：
0
作者：
Tomomi;Sato;加藤博章
通讯作者：
加藤博章

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Kashiwayama;Y.;Tsugumi Nakanishi;Takao Hibi;Hiroyuki Shibata;Tatsuya Uzumaki;Kentaro Ifuku;Toru Komatsu et al.;Mamoru Matsubara;Tasuku Ueno et al.;加藤博章;Yu Gabe et al.;Kazuki Kiyose et al.;Takuya Terai et al.;Takatoshi Yogo et al.;Mako Kamiya et al.;Kensuke Komatsu et al.;Eita Sasaki et al.;Yasuteru Urano et al.;Eri Kawabata et al.;Shigeki Hattori et al.;Tasuku Ueno et al.;Kenjiro Hanaoka et al.;Daisuke Nagata et al.;Suguru Kenmoku et al.;Yu Gabe et al.;Horie et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;Kunieda et al.
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通讯作者：
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Kashiwayama;Y.;Tsugumi Nakanishi;Takao Hibi;Hiroyuki Shibata;Tatsuya Uzumaki;Kentaro Ifuku;Toru Komatsu et al.;Mamoru Matsubara;Tasuku Ueno et al.;加藤博章;Yu Gabe et al.;Kazuki Kiyose et al.;Takuya Terai et al.;Takatoshi Yogo et al.;Mako Kamiya et al.;Kensuke Komatsu et al.;Eita Sasaki et al.;Yasuteru Urano et al.;Eri Kawabata et al.;Shigeki Hattori et al.;Tasuku Ueno et al.;Kenjiro Hanaoka et al.;Daisuke Nagata et al.;Suguru Kenmoku et al.;Yu Gabe et al.;Horie et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;K.Yoshizawa;K.Yoshizawa;K.Yoshizawa;W.I.Li;Kubota et al.;T.Shioiri;F.Yokokawa
通讯作者：
F.Yokokawa