X線結晶解析とタンパク質工学的方法によるアスパラギン合成酵素の活性中心の決定

利用 X 射线晶体学和蛋白质工程方法测定天冬酰胺合酶的活性中心

基本信息

批准号：
08660108
负责人：
加藤博章
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、分子進化的な考察を基に、X線結晶解析と部位特異的アミノ酸置換を併用してアスパラギン合成酵素の活性中心残基を決定することにある。アスパラギン合成酵素とアスパラギン酸tRNA合成酵素について、X線結晶構造に基づくアミノ酸配列の比較から、アスパラギン合成酵素の活性中心残基であると考えられる4つの残基、Arg100、Gln116、Ser251、そしてArg299を取り上げ、部位特異的変異を行い、反応速度論的な性質を調べて変異導入の効果を評価した。その結果、R100KのK_m値は野性型と同程度の値を示したが、K_0は1/270に減少した。Q116Aでは基質ATPに対するK_m値は野生型と大きな差は見られなかったが基質L-Aspに対するK_m値は20倍に増大し、k0に関しては野生型の5倍に低下した。S251AのK_mは野性型とほぼ変わらなかったものの、k_0は1/200に減少した。また、R299QとR299Aはそれぞれk_0が1/800、1/600に減少したがK_m値は野生型と比べ著しい変化は見られなかった。以上の結果から、R100、S251、R299はいずれも基質の認識よりも酵素反応を加速させるために重要な残基であることが判明した。また、Q116Aの結果から、Q116とL-Aspのβ位のカルボキシル基の相互作用がL-Aspの認識に関与すると考えられた。従って、本酵素が、L-Aspのα位とβ位のカルボキシル基を区別するには、アスパラギン酸tRNA合成酵素で保存されていないQ116が重要な役割を持つと考えられた。

本研究的目的是结合 X 射线晶体分析和基于分子进化考虑的位点特异性氨基酸取代来确定天冬酰胺合酶的活性中心残基。基于X射线晶体结构对天冬酰胺合成酶和天冬氨酸tRNA合成酶的氨基酸序列进行比较，发现Arg100、Gln116、Ser251和Arg299这四个残基被认为是天冬酰胺合成酶的活性中心残基。 -特异性诱变并研究反应动力学特性以评估诱变效果。结果，R100K的K_m值与野生型相当，但K_0下降至1/270。在Q116A中，底物ATP的K_m值与野生型没有显着差异，但底物L-Asp的K_m值增加了20倍，k0降低至野生型的5倍。尽管S251A的K_m与野生型几乎相同，但k_0下降至1/200。此外，在R299Q和R299A中，k_0分别降低至1/800和1/600，但与野生型相比，K_m值没有观察到显着变化。上述结果表明，R100、S251和R299都是对加速酶促反应比对底物识别更重要的残基。此外，根据Q116A的结果，认为Q116与L-Asp的β位羧基之间的相互作用参与了L-Asp的识别。因此，天冬氨酸tRNA合成酶中不保守的Q116被认为在使该酶区分L-Asp的α位和β位羧基方面发挥着重要作用。

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Toru Nakatsu: "Crystal Structure of Asparagine Synthetase from Escherichia coli B" Abstract for Congress of International Union of Crystallography. 17. C-114 (1996)

Toru Nakatsu：“来自大肠杆菌 B 的天冬酰胺合成酶的晶体结构”国际晶体学联盟大会摘要。

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加藤博章: "いまタンパク質結晶学はどうなっている....第17回国際結晶学連合大会に出席して" 日本農芸化学会誌. 70. 1369-1371 (1996)

Hiroaki Kato：“蛋白质晶体学现在发生了什么......参加第 17 届国际晶体学联盟大会”日本农业化学学会杂志 70. 1369-1371 (1996)。

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