糖鎖修飾によるタンパク質構造安定化機構の構造生物学的研究

糖基化蛋白质结构稳定机制的结构生物学研究

基本信息

批准号：
17046008
负责人：
加藤博章
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17046008/
关键词：
糖鎖タンパク質酵素 X線結晶構造解析 X線結晶解析構造生物学

项目摘要

本研究は、リンゴ銀葉病菌(Stereum purpureum)の生生するペクチン質分解素、エンドポリガラクツロナーゼI(endoPG I)を対象として、その糖鎖修飾による構造安定化機構について構造生物学的に解明することを目的とした。大腸菌を用いて得られた組換えendoPG Irは温度安定が20℃低下した。両者のアミノ酸配列は同一であることから、この熱安定性の低下は、糖鎖修飾が行われなかったためと考えられた。そこで、endoPG Irについて酵素単独の構造と反応生成物ガラクツロン酸(GalpA)との複合体それぞれの立体構造を決定し、それぞれの構造の違いを調べた。その結果、糖鎖付のendoPG IにおいてAla89-Ile94のループの動きをAsn92への糖鎖修飾が抑制することを結晶構造中で確認した。しかし、さらに解析を進めた結果、Asn92への糖鎖付加によるループ構造の安定化は、結晶化に伴うタンパク質分子同士の接触によるものであり、溶液中では影響がないであろうと考えられた。一方、糖鎖付のendoPG Iと糖鎖なしのendoPG Irを示差熱量計(DSC)解析で比較したところ、endoPG IrはendoPG Iに対し変性温度がほぼ同じ分子と約13度低下した分子の混合物であることが示唆された。そこで、両者の結晶構造を詳細に比較した結果、endoPG Irの一部の分子はCys300-Cys303間のジスルフィド結合が形成されておらず、これが熱安定性低下の主要因と考えられた。そこで、DSCで判明した低温側の変性温度70℃で処理し、変性物を除いたendoPG IrについてX線結晶構造解析を行なったところ、問題のジスルフィド結合が完全に形成されていることが確認された。

本研究旨在阐明通过糖链修饰来稳定内多聚半乳糖醛酸酶 I (endoPG I) 结构的结构生物学机制，该酶是一种由 Stereum purpureum 产生的果胶降解酶。使用大肠杆菌获得的重组endoPG Ir的温度稳定性降低了20°C。由于两者的氨基酸序列相同，因此热稳定性的降低被认为是由于缺乏糖基化造成的。因此，我们确定了endoPG Ir作为单独酶和与反应产物半乳糖醛酸（GalpA）的复合物的三维结构，并研究了两种结构之间的差异。结果，在晶体结构中证实了Asn92的糖链修饰抑制了endoPG I中Ala89-Ile94环与糖链的运动。但进一步分析发现，Asn92添加糖链所带来的环结构的稳定是由于结晶过程中蛋白质分子之间的接触，在溶液中不会产生任何影响。另一方面，当通过差示量热法(DSC)分析比较具有糖链的endoPG I和不具有糖链的endoPG Ir时，发现endoPG Ir是变性温度大致相同的分子和变性温度分子的混合物。变性温度比endoPG I低约13度。有人建议对两者的晶体结构进行详细比较的结果发现，在endoPG Ir的某些分子中，Cys300和Cys303之间没有形成二硫键，这被认为是热性能下降的主要原因。稳定。因此，当endoPG Ir在DSC确定的70℃的低温变性温度下进行处理并除去改性产物时，进行X射线晶体结构分析，并证实所讨论的二硫键完全形成。塔。

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Expression, purification and crystallization of endopolygalacturonase from a pathogenic fungus, Stereum purpureum, in Escherichia coli

病原真菌紫紫菌内切多聚半乳糖醛酸酶在大肠杆菌中的表达、纯化和结晶

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
Protein Expression and Purification 44・2
影响因子：
0
作者：
Shimizu;T.
通讯作者：
T.

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通讯作者：
F.Yokokawa