脂質輸送型ABC蛋白質の分子構造と役割の解明

阐明脂质转运 ABC 蛋白的分子结构和作用

基本信息

批准号：
20H02912
负责人：
小段篤史
金额：
$ 11.48万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、ヒト由来の脂質輸送型ABCタンパク質を対象とし、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析、生化学的解析、及び細胞生物学的解析などの多面的な解析により、脂質輸送型ABCタンパク質の作用機構と生理的役割を解明すること目的とする。ABCタンパク質は12－17 回膜貫通αへリックスをもつ蛋白質であり、特にABCA1は2261アミノ酸残基の大きな膜タンパク質である。そのため、機能を保持したまま大量に精製することは容易ではない。2021年度は、機能状態に近いABCA1立体構造を決定することを目指し、脂質ナノディスクへ再構成したABCA1試料を用いてクライオ電子顕微鏡によるデータ収集および単粒子解析を実施した。ヒトABCA1をヒト由来のFreeStyle 293細胞を用いた一過性発現系により発現させ、活性を保ち単分散性の高い状態で精製サンプルを取得し、精製ABCA1を脂質ナノディスクへ再構成した。試料を負染色解析することにより、単分散性が良好であることを確認した後、クライオ電子顕微鏡解析のためのグリッド作製を実施した。試料の溶液条件、タンパク質濃度、グリッドへのアプライ量、ろ紙によるブロット時間等、データ収集のために最適な条件を決定した。作製したグリッドを用いて、クライオ電子顕微鏡によるデータ収集を行い、単粒子解析を実施したところ、ABCA1粒子の二次元平均像さらには初期三次構造を得ることができた。現在、三次構造のさらなる精密化を行っており、今後、機能状態に近いABCA1立体構造を明らかにできると期待している。

本研究重点关注源自人类的脂质转运ABC蛋白，并利用冷冻电子显微镜的单颗粒分析、生化分析和细胞生物学分析等多方面分析来研究脂质转运ABC蛋白的作用。阐明其机制和生理作用。 ABC蛋白是具有12-17个跨膜α螺旋的蛋白质，特别是ABCA1是具有2261个氨基酸残基的大膜蛋白。因此，在保留其功能的情况下对其进行大量纯化并不容易。 2021年，我们使用冷冻电子显微镜收集数据，并使用重组为脂质纳米盘的ABCA1样品进行单颗粒分析，目的是确定ABCA1接近其功能状态的三维结构。使用人源FreeStyle 293细胞通过瞬时表达系统表达人ABCA1，获得活性保持且高度单分散的纯化样品，并将纯化的ABCA1重构为脂质纳米盘。通过样品的负染色分析确认良好的单分散性后，进行冷冻电子显微镜分析的网格制备。确定了数据收集的最佳条件，包括样品溶液条件、蛋白质浓度、施加到网格上的量以及滤纸印迹时间。使用准备好的网格，我们使用冷冻电子显微镜收集数据并进行单颗粒分析，并且能够获得ABCA1颗粒的二维平均图像以及初始三级结构。我们目前正在努力进一步完善三级结构，希望将来能够揭示ABCA1接近其功能状态的三维结构。