p53のユビキチン経路における分解

泛素通路中 p53 的降解

基本信息

批准号：
11139265
负责人：
安田秀世
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11139265/
关键词：
p53 ユビキチン MDM2 MDMX p73 DNA依存性タンパク質りん酸化酵素

项目摘要

(研究目的)癌抑制遺伝子産物p53がDNA損傷に呼応して細胞内含量が増加することが知られているが、この増加はp53のユビキチン-プロテオソーム系による分解が抑えられる為と考えられる。E6/E6AP、ユビキチンリガーゼが作用するパピローマウイルス16、18型が感染している細胞ではウイルス由来タンパク質E6が細胞内タンパク質E6APと結合し、p53のユピキチンリガーゼとして作用するごとが明かとなっている。ところが上記ウイルスが感染していない細胞でのp53のユピキチン化の機構は明かになっていない。そこでこの機構を明かにしていくことがp53の細胞内での安定化、不安定化を考えるために重要と考えられる。そこでp53のユビキチンリガーゼの同定と諸性質を明かにすることを研究の目的とした。(結果)各種タンパク質をバキュロウイルス発現系、大腸菌発現系を用いて発現、精製後、ビオチン標識ユビキチンを用いて試験管内でタンパク質のユビキチン化反応をおこなった。ビオチン標識ユピキチン化タンパク質はSDSポリアクリルアミド電気泳動の後、パーオキシダーゼ標識アピジンによって検出した。点突然変異はPCR法を用いて導入した。1、MDM2はE1およびE2としてUBCH5存在下、p53をユピキチン化するユピキチンリガーゼとして働き、また自己もユビキチン化する活性を持つ。また、DNA依存性タンパク質りん酸化酵素でりん酸化されたp53はこのユビキチン化を受けなくなった。2、MDM2のC末に存在するリングドメイン構造を点突然変異導入によって破壊するとユビキチンリガーゼ活性は消失した。3、MDM2の構造類似タンパク質MDMXにはユビキチンリガーゼ活性が存在しなかった。これはMDMXのC末にあるリングドメイン様構造は完全なものでない為と考えられる。4、p53類縁癌抑制遺伝子産物p73α、βいずれもMDM2によるユピキチン化は観察されなかった。

(研究目的) 已知肿瘤抑制基因产物p53的细胞内含量随着DNA损伤而增加，这种增加被认为是由于泛素-蛋白酶体系统抑制p53降解所致。在感染了 16 型和 18 型乳头瘤病毒的细胞中，E6/E6AP 和泛素连接酶发挥作用，研究表明，病毒来源的蛋白 E6 与细胞内蛋白 E6AP 结合，并充当 p53 泛素连接酶。然而，未感染上述病毒的细胞中p53上泛素化的机制尚不清楚。因此，阐明这一机制对于考虑细胞内 p53 的稳定和不稳定非常重要。因此，本研究的目的是鉴定和阐明p53泛素连接酶的特性。 (结果) 使用杆状病毒表达系统和大肠杆菌表达系统表达并纯化各种蛋白质后，使用生物素标记的泛素在体外进行蛋白质的泛素化反应。 SDS-聚丙烯酰胺电泳后，通过过氧化物酶标记的 apidine 检测生物素标记的上氨酸蛋白。使用PCR方法引入点突变。 1. MDM2作为一种泛素连接酶，在UBCH5存在的情况下将p53上调为E1和E2，并且还具有自身泛素化的活性。此外，已被 DNA 依赖性蛋白激酶磷酸化的 p53 不再受到这种泛素化的影响。 2.当MDM2 C末端的环结构域结构被点突变破坏时，泛素连接酶活性消失。 3. MDMX是一种与MDM2结构相似的蛋白质，不具有泛素连接酶活性。这被认为是因为MDMX C末端的环状结构域结构不完整。 4.未观察到MDM2对p53相关抑癌基因产物p73α和p73β的去素化。