リングフィンガー型ユビキチンリガーゼ活性を持つがん遺伝子産物の研究

具有环指泛素连接酶活性的癌基因产物的研究

基本信息

批准号：
13216100
负责人：
安田秀世
金额：
$ 2.82万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13216100/
关键词：
p53 SUMO E3 PIAS

项目摘要

p53のSUMO化のE3、SUMOリガーゼの同定SUMO化の過程はユビキチン化の過程と似通っていると考えられ、ユビキチン化にみられるE1、E2酵素はそれぞれSua1/Uba2、Ubc9として同定されている。ところがタンパク質基質を認識し、ユビキチン化する酵素E3、ユビキチンリガーゼに相当するSUMOリガーゼは同定されていなかった。そこで酵母は哺乳類のSUMOを結合できるUbc9を持っていることからSUMOをバイト(餌)にして2-ハイブリッド法を行ったところ得られたクローンの中にリングフィンガー様構造を持った遺伝子が存在した。このリングフィンガー様構造を持つタンパク質はこのE3の可能性が考えられた。このタンパク質はヒトPIAS1タンパク質のマウス相同遺伝子、miz1であった。そこでヒトPIAS1を用いてSUMOのE2であるhUbc9との結合を酵母2-ハイブリッド法により検討した。その結果SUMOのE2、hUbc9の結合が観察された。実際にU2OS細胞にp53、SUMO、PIAS1を移入すると、PIAS1の存在に依存して、p53は強くSUMO化され、また、PIAS1のリングフィンガー様構造の変異体ではこのような作用は観察されなかった。PIAS1が細胞内でp53のSUMO化を促進したことからSUMO-E3の可能性が示唆された。そこで次にPIAS1のin vitroでの酵素活性を検討した。p53、SUMO、hUbc9、PIAS1それぞれを大腸菌、あるいはバキュロウイルス系を用いて昆虫細胞で発現させ精製した後、in vitroでp53のSUMO化反応を検討した。その結果、p53のSUMO化はPIAS1存在下で強くみられ、PIAS1がSUMO-E3として働く可能性が強く示唆された。

p53 SUMO化的E3和SUMO连接酶的鉴定 SUMO化的过程被认为与泛素化过程相似，参与泛素化的E1和E2酶已分别被鉴定为Sua1/Uba2和Ubc9。然而，识别蛋白质底物并将其泛素化的酶E3和对应于泛素连接酶的SUMO连接酶尚未被鉴定。由于酵母具有可以结合哺乳动物SUMO的Ubc9，因此我们以SUMO为诱饵进行了二杂交方法，发现获得的克隆中存在一个具有无名指状结构的基因。人们认为具有这种无名指状结构的蛋白质可能是E3。该蛋白是 miz1，是人类 PIAS1 蛋白的小鼠同源物。因此，我们利用人PIAS1，利用酵母双杂交方法研究了SUMO与hUbc9（E2）的结合。结果，观察到SUMO与E2和hUbc9的结合。当p53、SUMO和PIAS1实际上被引入U2OS细胞中时，p53根据PIAS1的存在而被强烈SUMO化，并且在PIAS1的无名指样结构突变体中没有观察到这种效果。 PIAS1促进细胞中p53的SUMO化，提示SUMO-E3的可能性。因此，我们接下来研究了PIAS1的体外酶活性。使用大肠杆菌或杆状病毒系统在昆虫细胞中表达和纯化p53、SUMO、hUbc9和PIAS1后，我们研究了p53的体外SUMO化反应。结果，在 PIAS1 存在的情况下强烈观察到 p53 SUMO 化，强烈表明 PIAS1 可能发挥 SUMO-E3 的作用。