リングフィンガー型ユビキチンリガーゼ活性を持つがん遺伝子産物の研究

具有环指泛素连接酶活性的癌基因产物的研究

基本信息

批准号：
13216100
负责人：
安田秀世
金额：
$ 2.82万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13216100/
关键词：
p53 SUMO E3 PIAS

项目摘要

p53のSUMO化のE3、SUMOリガーゼの同定SUMO化の過程はユビキチン化の過程と似通っていると考えられ、ユビキチン化にみられるE1、E2酵素はそれぞれSua1/Uba2、Ubc9として同定されている。ところがタンパク質基質を認識し、ユビキチン化する酵素E3、ユビキチンリガーゼに相当するSUMOリガーゼは同定されていなかった。そこで酵母は哺乳類のSUMOを結合できるUbc9を持っていることからSUMOをバイト(餌)にして2-ハイブリッド法を行ったところ得られたクローンの中にリングフィンガー様構造を持った遺伝子が存在した。このリングフィンガー様構造を持つタンパク質はこのE3の可能性が考えられた。このタンパク質はヒトPIAS1タンパク質のマウス相同遺伝子、miz1であった。そこでヒトPIAS1を用いてSUMOのE2であるhUbc9との結合を酵母2-ハイブリッド法により検討した。その結果SUMOのE2、hUbc9の結合が観察された。実際にU2OS細胞にp53、SUMO、PIAS1を移入すると、PIAS1の存在に依存して、p53は強くSUMO化され、また、PIAS1のリングフィンガー様構造の変異体ではこのような作用は観察されなかった。PIAS1が細胞内でp53のSUMO化を促進したことからSUMO-E3の可能性が示唆された。そこで次にPIAS1のin vitroでの酵素活性を検討した。p53、SUMO、hUbc9、PIAS1それぞれを大腸菌、あるいはバキュロウイルス系を用いて昆虫細胞で発現させ精製した後、in vitroでp53のSUMO化反応を検討した。その結果、p53のSUMO化はPIAS1存在下で強くみられ、PIAS1がSUMO-E3として働く可能性が強く示唆された。

p53中E3和SUMO连接酶的鉴定被认为与泛素化相似，并且在泛素化中看到的E1和E2酶分别被鉴定为SUA1/UBA2和UBC9。然而，尚未鉴定出与识别蛋白质底物和泛素化的酶E3相对应的相对应的相对应。因此，酵母具有可以结合哺乳动物相扑的UBC9，因此，当Sumo用作咬合（诱饵）并进行2杂交方法时，在获得的克隆中发现了带有环手指状结构的基因。该蛋白质具有这种环手指状结构被认为是E3的可能性。该蛋白是Miz1，是人类PIAS1蛋白的小鼠同源基因。因此，使用人类PIAS1通过酵母2杂交方法研究Sumo与Hubc9，E2的结合。结果，观察到E2和HUBC9在SUMO中的结合。实际上，当p53，Sumo和Pias1被转移到U2OS细胞中时，p53被强烈掺杂，具体取决于PIAS1的存在，并且在具有PIAIS1的环形结构的突变体中未观察到这种影响。 PIAS1促进了细胞中p53的Sumoylation，这表明SUMO-E3的可能性。因此，我们接下来研究了PIAS1的体外酶活性。 p53，Sumo，Hubc9和Pias1在使用大肠杆菌或杆状病毒系统中纯化并纯化后，对p53的Sumoylation进行了纯化。结果，在PIAS1存在下强烈观察到p53的sumoylation，这表明PIAS1可以充当SUMO-E3。