哺乳類細胞の分裂期染色体凝縮、脱凝縮の制御機構

哺乳动物细胞有丝分裂染色体凝聚与解凝聚的控制机制

基本信息

批准号：
09263212
负责人：
安田秀世
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09263212/
关键词：
myt1キナーゼ wee1キナーゼサイクリンB APC ユビキチン p53 MOM2 Cut2

项目摘要

バキュロウイルス系で発現、精製したmyt1はcyclinE/CDK2を燐酸化せず、cyclinB/cdc2を特異的に燐酸化し、wee1はcdc2およびCDK2のいずれをも燐酸化した。一方、Sf-9細胞中ではmyt1はcyclinB/cdc2の14Thrおよび15Tyrの両残基を燐酸化したがcyclinE/CDK2を基質としなかった。wee1はcdc2キナーゼ、CDK2いずれも燐酸化した。この時、cdc2キナーゼに対してはmyt1による燐酸化がwee1キナーゼによる燐酸化より効率が高かった。またp35/CDK5はwee1により燐酸化されたがmyt1による燐酸化は観察されなかった。以上よりmyt1、wee1はCDKsの基質特異性に違いがあることが確認された。それら酵素の細胞内局在はHeLa細胞中でGFPとの融合蛋白質として発現したwee1は核に局在するのに対して、myt1は細胞質に存在し、myt1の配列中に含まれる膜局在シグナルと思われる領域を欠損させるとこの局在は解消され、細胞内に均一に存在するようになった。APCに関係してはGST-サイクリンB/cdc2複合体、ビオチン化ユビキチンを基質として、マウスユビキチン活性化酵素(E1)とHeLa細胞の抽出液を酵素源としたin vitroサイクリンBユビキチン化の系を用いてサイクリンBのユビキチン化に関与するE2、hE2Cを単離した。またこのhE2Cは分裂酵母のCut2もdestruction box依存的にユビキチン化した。さらにこのhE2Cを餌に酵母2ハイブリッド系により新規遺伝子を単離した。この遺伝子はユビキチンリガーゼの活性を有していた。このE3様タンパク質がサイクリンB特異的であり、APCの成分であるかどうか興味深いところである。またこのユビキチン化の研究段階で癌抑制遺伝子産物p53をユビキチン化するリガーゼとして癌遺伝子MDM2を同定した。

使用杆状病毒系统表达和纯化的 myt1 不磷酸化 cyclinE/CDK2，但特异性磷酸化 cyclinB/cdc2，而 wee1 磷酸化 cdc2 和 CDK2。另一方面，在Sf-9细胞中，myt1磷酸化cyclinB/cdc2的14Thr和15Tyr残基，但不使用cyclinE/CDK2作为底物。 Wee1 磷酸化 CDC2 激酶和 CDK2。此时，myt1 的磷酸化对于 CDC2 激酶比 wee1 激酶的磷酸化更有效。此外，p35/CDK5 被 wee1 磷酸化，但未观察到 myt1 磷酸化。由上可知，myt1和wee1在CDK的底物特异性上存在差异。关于这些酶的细胞内定位，在 HeLa 细胞中表达为与 GFP 融合蛋白的 wee1 定位于细胞核，而 myt1 存在于细胞质中，并且 myt1 序列中包含的膜定位信号定位于当被认为被删除的区域被删除时，这种定位就被废除，并且它均匀地存在于细胞内。关于APC，我们开发了一种体外细胞周期蛋白B泛素化系统，以GST-细胞周期蛋白B/CDC2复合物和生物素化泛素为底物，小鼠泛素激活酶（E1）和HeLa细胞提取物为酶源，我们使用这种方法进行分离。 hE2C，一种参与细胞周期蛋白 B 泛素化的 E2。该 hE2C 还以破坏盒依赖性方式泛素化裂殖酵母中的 Cut2。此外，我们使用酵母双杂交系统使用该 hE2C 作为诱饵分离了一个新基因。该基因具有泛素连接酶活性。有趣的是，这种 E3 样蛋白是否对细胞周期蛋白 B 具有特异性并且是 APC 的组成部分。此外，在泛素化研究阶段，我们鉴定出癌基因MDM2是一种泛素化抑癌基因产物p53的连接酶。